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1、1支气管肺泡灌洗液实时荧光定量 PCR 检测诊断不典型肺结核作者：李钋邢岚陈晓艳马慧侯秀峰田永丽 【关键词】支气管肺泡灌洗液实时荧光定量 PCR 结核分枝杆菌不典型肺结核 肺结核是呼吸科常见疾病，目前肺结核的诊断金标准是痰菌阳性，菌阴肺结核的诊断缺乏金标准，我们采用实时荧光定量 PCR 技术检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中的结核分支杆菌 DNA，并与涂片和培养法比较，以评价实时荧光定量PCR 检测 BALF 中结核分支杆菌在不典型肺结核诊断中的价值。 1 材料与方法 1.1 研究对象我院已经临床确诊的住院肺结核患者 18 例。依据结核中毒症状，细菌学或病理学检查，结合 X 线、CT 表现及(
2、或)抗结核治疗，随诊 36 个月病灶逐渐吸收而确诊。另选 20 例本院住院的非结核肺部疾病者作为对照。其中急慢性支气管炎 11 例，肺炎 5 例，肺癌 4 例。 1.2 研究方法所有病例结合肺 CT 按病变部位选择灌洗肺段，应用电子支气管镜检查并行经支气管镜防污染支气管肺泡灌洗术（PBAL） ，并对所取标本即时做 PCR 检测，涂片查结核分支杆菌和结核分支杆菌培养。 1.3 检测方法支气管肺泡灌洗液涂片作抗酸染色镜检，结核分支杆菌培养及菌型鉴定按照中国防痨协会结核病细菌学检测方法进行。实时荧光检测 PCR 检测：结核分枝杆菌核酸扩增荧光检测试剂盒，由中山大学达安基因股份有限公司生产，FQ-PC
3、R 仪为美国 MX3000P 基因扩增仪，操作步骤严格按照说明进行。 电子支气管镜采用 OLYMPUSCV260 型，消毒方法：全自动消毒清洗机清洗。 1.4 统计学方法采用 x2 检验。P0.05 具有统计学意义。 2 结果 结核组与非结核组 BALF 三种方法检测结果：肺结核组患者 BALF 涂片、培养及 PCR 的阳性率则分别为 11%（2 例） 、17%（3 例）及 61%（11 例） 。本组病例的PCR 结果分别与涂片和培养比较，差异有显著性，x2 检验示 P0.01。非肺结核组中 BALFPCR 阳性 1 例(5%)。 3 讨论 肺结核是一种感染性疾病，病因明确，目前实验室诊断是确
4、诊结核病的主要依据。涂片法简单、快速、经济，但灵敏性差，检出率低，通常 5000-10000 条菌/ml 才能得到阳性结果，且不能将结核杆菌与其他分枝杆菌区分开来。培养法一般要 4-8 周，快速培养也要 2 周。荧光定量 PCR 是近年用于临床病原菌检测的一种具有高灵敏性、高准确性、高特异性、定量范围宽、操作简便、快速安全、污染最少的可靠的 DNA 体外扩增技术。荧光定量 PCR 法能稳定检测 10copies 结核杆菌基因组 DNA，灵敏度高。随着分子生物学技术的开展，荧光定量 PCR 技术把核酸扩增、杂交及光谱技术结合在一起，在封闭状态下检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性，利用特异性探针
5、，实时监测，与自动分析一体化，实现精确、特异、简便、快速的检测。本组病例中支气管肺泡灌洗液直接取材于病灶处支气管肺泡内，细菌浓度高，污染几率低，且无痰患者也可以检测。我们采用 FQ-PCR 法检测 BALF 中的 TB-DNA，肺结核组阳性率为 61%，显著高于 BALF 涂片及培养（P0.05） ；非肺结核组阳性率只有 5%。表明 FQ-PCR 仍有假阳性结果，但较2PCR 检测明显降低（国内有报道 17.64%1） 。由于 PCR 不能区分死菌与活菌，对于治愈的肺结核，如果肺内有死的结核杆菌，仍可抽提到 DNA，PCR 检测仍可为阳性，此时对病情的判断应该结合临床其他检查结果综合判断。 通
6、过本组病例检测我们认为，实时荧光定量 PCR 检测肺泡灌洗液中结核分枝杆菌 DNA 阳性检出率高可能与肺泡灌洗液进入远端气道及肺泡腔中，接触病灶范围广，收集量大，含菌量多有关，标本充分离心沉淀，灌洗刺激患者咳嗽，更有利于局部支气管分泌物的引流。荧光探针定量 PCR 法检测 BALF 中结核杆菌的DNA 是快速诊断结核杆菌感染的一种非常有前途的方法，对肺部可疑结核病，而痰菌检查又是阴性的病人，可采用支气管镜肺泡灌洗液结核分枝杆菌 DNA 检测，以提高确诊率。结果表明，此方法诊断肺结核具有快速、特异、敏感的特点，是一种值得临床推广的方法。 参考文献 1张红漫,李志惠,赵杰,等.荧光定量 PCR 测定支气管肺泡灌洗液中 TbDNA对涂阴肺结核的诊断价值.中国防痨杂志，2009，31(4):227-229.
