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1、1持续动态压应力下骨折愈合时环氧化酶及相关信号分子的表达作者：任可张春才汪光晔赵建宁陆维举李波【摘要】目的：探讨持续动态压应力环境对实验性骨折愈合时环氧化酶mRNA 表达水平以及前列腺素 E2(PGE2)和环磷酸腺苷(cAMP)含量的影响.方法：80只新西兰兔行单侧肱骨干横断截骨，实验组以天鹅记忆接骨器内固定，在骨折端造成持续动态压应力，对照组以 4 孔加压钢板固定.分别于术后第3，7，14，21，28，56，84 日时，在骨折间隙内取材，行组织学、放射免疫和RealtimeRTPCR 等观察及检测.结果：环氧化酶2(COX2)mRNA 的表达量以及 PGE2 和 cAMP 的含量均较骨折前显
2、著上升，且实验组在术后 34wk 时以上指标明显高于对照组，组织学结果则显示实验组骨折间隙内软骨内成骨和编织骨向板层骨的改建均领先于对照组.结论：天鹅记忆接骨器产生的持续动态压应力通过COX2 ，PGE2 和 cAMP 这一信号通路使得成骨细胞分化成熟，促进了骨折愈合.【关键词】骨折内固定术；骨折愈合；应力；环氧化酶；前列腺素 E2；形状记忆合金【Abstract】AIM:Toexploretheeffectofcontinuousdynamicpressurestressoncyclooxygenase(COX)mRNAexpressionandprostaglandinE2(PGE2)an
3、dcAMPcontentsduringexperimentalfracturehealing.METHODS:Unilateralosteotomyoflefthumeraldiaphysiswasperformedin80adultNewZealandrabbits.Thehumeralfracturewasfixedwithswanlikememoryconnector(SMC)instudygroupandwith4holedynamiccompressionplate(DCP)incontrolgroup.Samplesfromthefracturegapswereobtainedat
4、3,7,14,21,28,56and84daysafteroperation.ThetemporalexpressionpatternsofCOXmRNAduringtherepairprocesswereexaminedthroughrealtimeRTPCR.ThecontentsofPGE2andcAMPweredetectedthroughradioimmunitymethodandtheprocessandqualityoffracturehealingwereobservedhistologically.RESULTS:TherelativelevelsofCOX2mRNAaswe
5、llasthecontentsofPGE2andcAMPwereelevatedafterfracture,andweresignificantlyhigherinstudygroupthanthoseincontrolgroupat3and4weekspostoperatively.Histologicalobservationrevealedthatthemineralizationofcartilagematrix,theendochondralboneformationandthecallusremodellingtookplaceearlierinstudygroup.CONCLUS
6、ION:ThepersistentdynamiclongitudinalpressurestressproducedbySMCmaycontributetoendochondralboneformationofcallusandacceleratefracturehealing,whichisconsideredtobecloselyrelatedwiththesignalingpathwaythathasseveralcriticalcomponentsincludingCOX2,PGE2andcAMP.【Keywords】internalfixation;fracturehealing;s
7、tress;cyclooxygenase;prostaglandinE2;shapememoryalloy0 引言骨折愈合是复杂的病理生理过程，并受到生物力学环境的调控.我们利用镍钛合金的形状记忆效应，根据临床使用的人体肱骨干天鹅型记忆接骨器按比例缩2小制成了兔肱骨干的形状记忆接骨器（shapememoryconnector，SMC）.该器械的材料性能和几何构型可以保证骨折处的稳定，并在骨折端产生持续动态的压应力1.这与其他内固定物的力学环境明显不同，临床应用显示骨折愈合速度快，成功率高.本实验考察了兔肱骨干骨折间隙内环氧化酶1(cyclooxygenase1,COX1) 、环氧化酶2(cyc
8、looxygenase2,COX2)mRNA 的表达情况以及前列腺素 E2(prostaglandinE2,PGE2)和环磷酸腺苷(cyclicadenosinemonophosphate,cAMP)含量与愈合进程的关系，旨在探讨持续动态压力环境对骨折愈合的影响及可能的机制.1 材料和方法1.1 材料1.1.1SMC 的制作取含镍 50%53%的镍钛合金板材，厚 1.5mm，依据兔肱骨干中段解剖特征，制成由体部、尾钩、轴向加压支和持骨部组成的 SMC.体部近端宽 8mm，远端宽6mm，持骨部远、近端内径分别为 5mm 和 7mm，内固定器的长度 30mm.热处理取向单程，形状恢复温度（332）
9、.将 SMC 置于 04的冰水中降温塑变，持针器展开持骨部，展距略大于骨骼直径.向背侧拉展加压钩，暂架于体部背侧，复位骨折端并将体部中点对准骨折处，比拟尾钩在近折段处的位置钻孔，置入 SMC，再依伸展后的加压钩所在皮质骨处钻孔并插入加压钩,用 4050温水复温完成固定1-2.1.1.2 兔肱骨干骨折 4 孔加压钢板的制作兔肱骨干骨折 4 孔加压接骨板(dynamiccompressionplate,DCP)及配套螺钉由上海浦卫医疗器械公司制造.其材料为 316L 不锈钢，长、宽、厚分别为 38，4 和 1.6mm.1.1.3 试剂DRR041SRealtimePCR 试剂盒和 DRR019AR
10、TPCR 试剂盒(TaKaRa 公司)；LightCycler实时定量 PCR 扩增仪（Roche 公司产品） ；兔 COX1 ，COX2 和5 磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehydesphosphatedehydrogenase,GAPDH)的引物由北京奥科公司合成，序列如下：COX1 ：5GGCTCGCAGGAGTACAGCTAC3 ，5AGGACGTGGTGGTCAATGTTC3；COX2 ：5TCCCTCATCTGCAACAATGTG3 ，5GCAGGACTGTGGGATTGATGT3 ；GAPDH：5CACCCACTCCTCTACCTTCG3 ，5CGTCCTCCTCTGGT
11、GCTCT3.PGE2 放射免疫分析试剂盒（苏州大学血液研究所产品） ；cAMP 放射免疫分析试剂盒（上海中医药大学核医学中心提供）.1.2 方法1.2.1 手术操作成年雄性新西兰兔 80 只，体质量(2.40.3)kg.25g/L 硫喷妥钠（25mg/kg）耳缘静脉注射诱导后，400g/L 氯安合剂（氯胺酮/安定 2mL/kg）腹腔麻醉.俯卧位消毒铺巾，经外侧切口暴露左侧肱骨干中部，线锯横形截骨.随机分为实验组和对照组，每组 35 只.实验组以 SMC 内固定，对照组以 DCP 内固定.止血、冲洗后关闭切口.术后分笼饲养，自由活动，并肌注青霉素钠 20 万 U/d，共 5d（图 1）.术后第
12、 3，7，14，21，28，56 和 84 日时，每组各处死 5 只兔，取骨折断端间隙内的骨痂组织留作标本，注意防止 RNA 酶污染.另外，两组分别再取 5 只兔，未经截骨手术即予处死，取其肱骨干中段骨质留作空白对照标本.A:对照组;B:实验组.1.2.2 组织学观察3术后 784d 的标本以 40g/L 多聚甲醛溶液固定，40g/LEDTA2Na 溶液脱钙，乙醇逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后连续切片，HE 染色，在 OlympusBH2光学显微镜下作光镜观察.1.2.3RealtimeRTPCR 分析术后 356d 的标本约每只动物各取 50mg，加入液氮迅速研磨至粉末状，再加入 2mLT
13、rizol，氯仿分离，水相层经异丙醇沉淀，RNA 产物溶解于 20LDEPC处理的双蒸水中.取总 RNA1g，按 DRR019A 试剂盒说明配制成反转录反应液10L，65水浴 1min，30放置 5min，65孵育 15min，98灭活逆转录酶5min，低温保存.配制 PCR 反应液：20L，内含 SYBRPremixExTaq(2)10L，上、下游 Primer(10mol/L)各 0.5L，RNaseFreedH2O8L.分别取 1L 反转录产物加入含三种引物的 PCR 反应液中，按以下条件反应：95预变性3min；952s，568s，721s 扩增，循环 40 次；绘制熔解曲线.以双 C
14、t 值法计算两组各时间点 COX1 和 COX2cDNA 模板数与 GAPDH 的相对值对于骨折前的变化趋势.1.2.4PGE2 和 cAMP 含量的测定电子天平称取 100mg 骨痂标本，加入生理盐水 3mL，电动匀浆，收集上清液，在 计数器中测量 PGE2 的放射性强度.精确称取 50mg 骨痂标本，置入醋酸缓冲液中，电动匀浆，上清吹干后按比例稀释，测定 cAMP 的放射性强度.根据标准曲线并计算样本的 PGE2 和 cAMP 含量.统计学处理：计量数据以 xs 表示，采用 SPSS11.5 统计软件进行分析，组别和愈合时间的主效应和交互作用以双因素方差分析考察，相同时间点的组间差异行成组
15、 t 检验.设定检验水准为 0.05.2 结果2.1 组织学观察术后 7d 时，两组骨折间隙内均为纤维肉芽组织结构.14d 时两组骨折间隙内软骨痂均基本形成，软骨基质呈淡蓝色.相比之下，实验组除软骨痂结构外还在部分区域出现了软骨内骨化现象，骨化前沿的软骨基质发生钙化.21d 时，实验组已初步形成典型的编织骨结构，骨小梁呈针状或薄片状，小梁中央为偏蓝的钙化软骨基质，周围部分为偏红色的骨组织（图 2A）.而对照组骨折间隙内虽已开始软骨内骨化，但仍有部分区域处于成熟的软骨痂阶段（图 2B）.术后 28d 时，两组骨折间隙内均已形成编织骨痂结构，可见很多排列不规则的骨小梁，小梁表面分布着较多成骨细胞.
16、相对而言，对照组残留的软骨成分更多些，实验组骨小梁中央部位已无蓝染的钙化软骨基质结构.56d 时，两组骨折端间均为完全的骨性结构，实验组基本成为板层骨结构，骨板沿骨纵轴方向整齐排列，并可见哈佛氏管结构（图 3A）.而对照组板层骨排列的方向性较差，细胞数量也较多（图 3B）.术后 84d 时，两组骨折间隙内均完全呈板层骨结构，但对照组骨基质方向仍稍显杂乱.2.2RealtimeRTPCR 结果愈合过程中，实验组和对照组以及各时间点之间 COX1mRNA 相对表达量均无统计学意义.COX2mRNA 的相对表达量均有统计学意义，但组别与愈合时间之间无明显交互作用.术后 3 及 4wk时实验组 COX2mRNA 的表达量明显高于对照组，差异具有统计学意义(P0.05，表 1)表 1COX1mRNA,COX2mRNA 相对表达量(略)2.3PGE2 和 cAMP 含量的测定结果
