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1、1持久稳定的大鼠小鼠造血嵌合体模型的建立作者：武小娟，李春富，唐湘凤，石磊【关键词】骨髓移植Establishmentofstableratmousehematopoieticchimeramodel【Abstract】AIM:Toestablishastableanimalmodelofhematopoieticchimerism.METHODS:ConditionedSDratsreceivedbonemarrowcellsfromBALB/cmousetoinducexenogeneicchimericrats.Thirtydayslater,lethallyirradiatedBALB
2、/cmicereceivedbonemarrowcellsfromchimericratsandtheirsurvivalratewasmonitoreddaily.Recipientsspleniccellswerestimulatedinmixedlymphocyteculture(MLC)withxenoantigenandskintransplantationwascarriedoutonday30.RESULTS:Acutegraftversushostdiseasewassignificantlyalleviated,thesurvivaltimewasprolongedandTc
3、ellproliferationwasinhibited.Morestablexenogeneicchimerismover90dwasachievedviareversebonemarrowtransplantation.CONCLUSION:Alongtermxenogeneicchimeramodelisestablishedbytransplantingbonemarrowcellsofchimeras.【Keywords】chimeramodel;wholebodyirradiation;bonemarrowtransplantation【摘要】目的：建立持久稳定的造血嵌合体模型.方
4、法：将预处理后的 SD 大鼠经尾静脉注射 BALB/c 小鼠骨髓细胞，诱导形成特异性耐受的嵌合体 SD 大鼠.30d 后，再将此嵌合体大鼠的骨髓反向移植给致死性照射后的 BALB/c 小鼠，监测小鼠的存活率，移植后 30d 做皮片移植和混合淋巴细胞培养，观察小鼠嵌合率的变化.结果：嵌合体模型小鼠仅有轻度移植物抗宿主病的表现，生存期明显延长，移植后嵌合率较稳定，移植皮片存活期延长，与对照组相比有显著性差异.结论：通过输入嵌合体骨髓的方法可建立稳定持久的大鼠小鼠嵌合体模型.【关键词】嵌合体模型；全身照射；骨髓移植0 引言大鼠小鼠的骨髓移植，通过对受体进行强烈的清髓性预处理或注射大量骨髓以获得可靠植
5、活，但异种移植物抗宿主病（XGVHD）较强，且嵌合状态随时间延长逐渐消失.为建立稳定的异种造血嵌合体，我们研究了协调性动物（大鼠小鼠）的骨髓移植模型，因为他们之间不存在天然的抗体，对异种移植物不会发生超急排斥(hyperacuterejection,HAR).先对供者进行预处理，使其产生对小鼠的特异性耐受，再将此嵌合体大鼠的骨髓反向移植给小鼠.由于此前嵌合体大鼠已对小鼠产生了特异性耐受，故将此耐受的骨髓植入小鼠体内可明显减轻 XGVHD，2并诱导出持久稳定的嵌合状态.1 材料和方法1.1 材料SD 大鼠(SPF 级)8 只，雌性，810 周龄.C57BL/6(H2b)小鼠 6 只，雌性，810
6、 周龄.BALB/c(H2d)小鼠 40 只（包括在 MLR 和病理检查中处死的小鼠，不编入各组计数） ，雌性，810 周龄，均购自第一军医大学实验动物中心,并饲养在清洁实验动物中心层流仓.PE 标记的抗小鼠 H2DdmAb(PharMingen 公司)；FITC标记的抗大鼠 MHCCLASSmAb(Serotec 公司)；3HTdR（中国原子能研究所） ；60Co 照射源(广东省辐照中心)；流式细胞仪（FACScan;BectonDickinson） ；自动液闪计数器（Beckman,USA）.1.2 方法1.2.1 嵌合体模型的建立 SD 大鼠于术前 5d 开始饮含红霉素(250mg/L)
7、和庆大霉素(320mg/L)的抗生素溶液.无菌条件下取 BALB/c 小鼠骨髓细胞,制成单细胞悬液,SD 大鼠接受 8Gy（照射率 0.5Gy/min）全身照射(TBI)后 4h 内经尾静脉输入 BALB/c 小鼠骨髓细胞 2108/只,48h 后腹腔注射环磷酰胺 50mg/kg1.30h后检测外周血嵌合率为 37.39%47.26%，证实小鼠源性骨髓已在大鼠体内植活.取上述嵌合体 SD 大鼠骨髓细胞,制成单细胞悬液,BALB/c 小鼠肠道净化后接受9Gy 全身照射，随即经尾静脉输入上述嵌合体骨髓细胞 4107/只.1.2.2 实验分组以 BALB/c 小鼠为受鼠的 A,B,C,D,E 组，均
8、接受 9Gy 的 TBI预处理：A 组（8 只）输注正常 SD 大鼠的骨髓细胞;B 组（8 只）输注嵌合体 SD大鼠的骨髓细胞;C 组（6 只）为自体移植组，D 组（6 只）为预处理组，不输注骨髓.以无关第 3 者 B6 小鼠为受鼠的 E 组（6 只）输注嵌合体 SD 大鼠的骨髓细胞.1.2.3 组织病理检查出现移植物抗宿主病表现的小鼠,濒死前活杀,B 组存活者于移植后第 60 日处死，取其肝、小肠和皮肤标本,以 100mL/L 甲醛溶液固定,常规石蜡包埋、切片,HE 染色,光镜下观察.按 ThomasGVHD 病理组织学分级标准判定2.1.2.4 嵌合率的测定取移植后小鼠外周血,加入 FIT
9、C 标记的抗大鼠MHCCLASSmAb(每 1106 细胞中加入 1g),避光,4,30min.红细胞裂解液去掉红细胞,PBS 洗涤 2 次,流式细胞仪检测嵌合率.1.2.5 皮肤移植及存活情况的观察参考文献3的方法,每日观察皮毛,如变硬或脱落视为移植排斥,柔软或鼠毛生长视为移植存活.1.2.6 混合淋巴细胞反应（MLR）移植后 30d，分别取 A,B 组小鼠与正常BALB/c 小鼠的脾细胞为反应细胞，以正常 SD 大鼠与 Whistar 大鼠脾细胞为刺激3细胞，做混合淋巴细胞反应（MLR） ，丝裂霉素灭活刺激细胞，于 96 孔培养板每孔加反应细胞 4105 个和刺激细胞 2105 个，设自体
10、反应孔，每组 3 复孔，培养 96h，终止培养前 18h，每孔加入 3.7104Bq（中国原子能研究所） ，液闪计数器测定，结果用 Bq 值 xs 表示.统计学处理：实验所得数据以 xs 表示,采用 SPSS12.0 软件进行数据分析.用 KaplanMeier 估计与绘制生存曲线,用方差分析比较各组脾细胞增殖程度的差异，组间多重比较用 LSD 法，用秩和检验分析各组移植皮片的存活期，用 t 检验分析外周血白细胞计数和嵌合率.2 结果2.1 嵌合体模型的生存期 A 组在 BMT 后 1wk 内出现体质量下降弓背体位、活动度差、毛脏乱等典型 GVHD 表现，第 5 日开始死亡并持续下去，仅 25
11、%存活超过 60d.B 组出现轻微的 GVHD,62.5%存活，与 A 组比较有显著性差异（LogRank 法比较，P0.05）.C 组均存活，D 组均在 BMT 后 10d 内死亡.用 KaplanMeier 评估生存曲线(Fig1)显示嵌合体骨髓细胞的输入可显著延长存活期，GVHD 发生率及严重度降低.E 组也出现严重 GVHD 表现，60d 时存活率仅 16.67%.2.2 移植皮肤存活情况 BALB/c 小鼠对特异供体 SD 及无关第三者 Wistar 皮肤的存活情况.经秩和检验 KruskalWallisH 法分析，P=0.01，经多重比较，B 组 BALB/c 小鼠对 SD大鼠皮肤
12、移植物的存活时间比 A 组明显延长（Tab1,P0.05).表 1BALB/c 小鼠异种皮肤移植物的存活情况（略）2.3 混合淋巴细胞反应移植第 30 日 A 组与 B 组小鼠脾细胞对供体 SD 大鼠脾细胞的单向混合淋巴细胞反应明显降低，经方差分析和 LSD 法的多重比较检验，与正常 BALB/c 小鼠相比 P0.001，B 组脾细胞增殖的抑制程度与 A 组有显著差别（P0.05）.移植后 60d 的混合淋巴细胞培养结果与 30d 时一致.2.4 嵌合率测定第 30 日时测定嵌合体模型的外周血嵌合率（Tab2） ，经 t 检验 B 组外周血嵌和率与 A 组比较无显著性差异.但随着时间推移，嵌合
13、率逐渐下降，A 组下降幅度较大，90d 时 A 组仅为(12.400.32)%，B 组嵌合率仍有(23.774.50)%(P0.05,因 A 组死亡率高，故嵌合率的样本数较少）.B 组造血恢复时间明显缩短，从第 9 日起外周血白细胞计数始终比 A 组高(Tab3)，显示反向 BMT 促进受者造血的重建.表 2BMT 后 30,60,90d 时 A,B 组小鼠外周血中大鼠源性细胞的比例（略）表 3BMT 后 30d 内 A,B 组小鼠外周血白细胞计数（略）2.5 病理分析 A,E 组死亡小鼠病理学改变符合 GVHD 病理变化.表现为：皮肤：基底细胞空泡变性、溶解坏死,大量淋巴细胞浸润；肝脏：肝细
14、胞呈不同程度的变性或坏死,汇管区有较广泛淋巴细胞浸润；小肠：肠黏膜水肿和出血,部分糜烂,小肠绒毛坏死脱落.黏膜下层淋巴细胞浸润.病理改变属于 GVHD级.B 组小鼠病理改变明显轻于 A,E 组,仅为轻度炎症反应，少量散在的肝细胞水肿变性，轻度小肠绒毛变钝，隐窝再生性改变，此为 GVHD级.43 讨论异种移植的排斥反应包括 HAR，急性血管排斥(AVR)以及急性细胞排斥(ACXR).AVR 主要以纤维蛋白沉积、出血和血栓导致的广泛缺血缺氧和器官衰竭为特征，血管是受攻击的主要目标，在肾移植中与肾小球血栓型微血管病有关4.关于ACXR 发生的确切机制尚存在某些不确定因素，在灵长类动物体内，由 CD4
15、+和CD8+T 细胞共同介导抗猪的免疫反应，NK 细胞也起重要的细胞毒作用，异种器官排斥期间发现有细胞性浸润5.实际上,异种移植的细胞免疫反应的程度很强,现有的免疫抑制剂能抑制同种异体移植的排斥反应，但不足以控制严重的异种排斥，并且导致长期的免疫缺陷，移植物排斥和病毒复制的激活6 ；因此,许多学者认为异种移植的关键是要诱导对异种抗原的特异性免疫耐受.利用造血嵌合体诱导供者特异性的耐受被认为是避免排斥较理想的方法.它允许供者和受者骨髓来源的树突细胞移入胸腺，代表供者和自身抗原，并诱发针对激活的 T 祖细胞的阴性选择，随即对同一供者来源的固体器官也产生耐受，而对第 3 者则排斥.Mohiuddin
16、 等7给大鼠 11Gy 致死性照射后，输注处理过的骨髓诱导小鼠大鼠完全嵌合体模型，随后行供体特异性心脏移植，移植物存活时间明显延长.此外，还有许多实验显示在混合嵌合体中可诱导供者器官长期存活8-10.异种移植物抗宿主病（XGVHD）是建立异种造血嵌合体的一个主要障碍，它与同种 GVHD 有一定的区别,主要是细胞免疫反应很强，XGVHD 更为严重，异种组织和器官较同种更难植入；异种供体细胞在受者体内的浸润和分布的部位、程度与同种不同，主要分布于淋巴造血组织及供者淋巴母细胞扩增部位11，12.目前，关于大鼠小鼠 BMT 模型的报道较多,建立稳定的嵌合体模型是诱导和维持供体特异耐受的重要途径.我们通过反向移植嵌和体骨髓的方法先使供者对受者抗原产生特异性的免疫耐受，对受者抗原不产生免疫应答，从而突破异种间的免疫屏障，明显减轻了 XG
