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1、2019/5/31,1,报告人：单吉浩,SPE技术在畜禽产品残留分析中的应用,2019/5/31,2,食品与农产品：残留分析要求,高选择性 降低或消除基质干扰 高灵敏度 痕量物质 可靠的结果：定量准确度和化合物确认 重现性，稳定性和动态范围 样品基质中低浓度目标物质的准确定量 按照法规要求进行确认 方法稳定性 复杂样品基质，减少样品净化操作,2019/5/31,3,残留分析:样品前处理的重要性,是影响实验成败的决定性步骤 占样品分析时间的比例最大(70-80%) 样品预处理所用时间远多于色谱分离的时间 占分析消耗总成本的比重最大 消耗大量的溶剂及其它化学品 对分析结果的重现性及准确性影响最大的
2、环节 影响实验结果好坏的最重要因素(回收率,%RSD）,2019/5/31,4,样品前处理的通用方法,高速离心取上清液 过滤、超滤 选择性沉淀 衍生反应 液-液萃取 固相提取(Solid Phase Extract, SPE),2019/5/31,5,为什么要用SPE?,样品浓缩 提高灵敏度 样品净化 提高灵敏度 延长系统不间断开机时间 延长色谱柱寿命 比液液萃取更快,节省溶剂 可自动化批量处理 重现性好,2019/5/31,6,不断革新的SPE技术,1977 率先推出业界第一个硅胶基质固相提取技术的商品化产品：Sep-Pak 1996 推出第一个水浸润性聚合物基质SPE吸附剂(OasisHL
3、B) 快速通用性反相SPE方法学 1997 用于OasisHLB的先进的新型方法学，可以获得更干净的本底(2D 优化方法学) 1999 推出混合机理吸附剂(OasisMCX 和MAX)，从而可以对碱性和酸性化合物进行高选择性和高灵敏度的提取 Oasis96 孔提取板设计获得R&D 100 大奖,2019/5/31,7,不断革新的SPE技术,2002 Waters 最新革新SPE技术 首次使得洗脱体积低至25 L 无需挥发与重现配制，洗脱后直接进样即可 是小体积样品的理想提取工具 灵敏度可以提高25x 2004 推出用于保留强碱(如季铵盐)和强酸(如磺酸盐)的WCX和 WAX 吸附剂,2019/
4、5/31,8,SPE小柱的种类,根据吸附剂的划分 正相 Silica /Alumina(A, B , N) / Florisil/ NH2/ CN 反相 C18/tC18/C8/tC2/Porapak/RDX/NH2/CN 离子交换 SCX、MCX、PCX、WCX、MAX,2019/5/31,9,传统(C18)SPE吸附剂的问题,对极性化合物保留不足 药物（农药）及代谢产物难以同时提取 对碱性化合物回收不足强硅羟基相互作用 碱性样品回收率低 小柱跑干不吸附 操作过程需仔细控制 回收率低，重现性差是其主问题。,2019/5/31,10,理想的样品处理方法,除去干扰物 在很宽的极性范围内，对酸性、
5、碱性及中性化合物均有可重现的高回收率 很容易实现自动化，对大量样品进行高通量处理 容易使用并且耐受性好 快速并且最终的成本低,2019/5/31,11,PEP (Polymer enhanced polymer) ：极性提高了的共聚物,具有反相SPE的最佳性质 pH：0-14，810m2/g 亲水性单体：亲水” 使填料具有水可浸润性质 允许溶剂跑干而不会损失回收率和重现性 “亲脂” 提供对分析物的反相保留能力,2019/5/31,12,C18与PEP小柱相比： 溶剂跑干对回收率的影响 (普鲁卡因胺、 醋氨酚、 雷尼替 丁、 心得安、 多虑平),2019/5/31,13,C18与PEP小柱相比：
6、 溶剂跑干对回收率的影响,2019/5/31,14,PEP可取代C18 的优势,吸附容量更大 是C18的3到10倍，常用规格1mL/30mg（C18：100mg） 操作更简便 小柱干涸不影响回收率 方法更通用 适合性质各异的各种物质的提取,2019/5/31,15,PEP可取代C18 的优势,开发方法更容易 聚合物基质，无硅醇基影响 对极性物质的提取回收率更高 药物(农药)及代谢产物同时提高,2019/5/31,16,样品前处理： 适于HPLC分析的通用SPE方法,此通用方法适于多种样品基质的绝大多数被测物。 当分析碱性化合物时，不要使用高有机含量的水溶液进行清洗，因为PEP吸附剂中不含硅醇基
7、。 首先使用通用方法提取。若需进一步降低干扰，可使用优化方法,2019/5/31,17,样品前处理： 适于HPLC分析的通用SPE方法,2019/5/31,18,pH 与化合物反相保留,2019/5/31,19,血清中的四环素,2019/5/31,20,血清中四环素的提取结果比较,SPE 化合物 %回收率 %RSD PEP 二甲胺四环素 94.8 1.4 四环素 104 0.55 C18 二甲胺四环素 52.8 2.82 四环素 68.4 2.44 6次实验结果：加标水平：2.5g/mL,2019/5/31,21,四环素类残留分析 （日本政府食品安全公告）,2003年月宣布有关来自中国的虾中的
8、四环素类药物监测 （Tetracycline in the shrimp from China） 如果为养殖虾，政府要求必须监测四环素类药物残留(mandatory) 如果为非养殖虾，政府推荐监测残留(voluntary) 需HPLC、荧光检测器 法规更新：蔬菜和蜂蜜加工的食品必须监测残留 法规以前不要求检测农药残留，但因在加工食品和蜂蜜中发现了许多农药，故现在要求检测,2019/5/31,22,食用肉中的四环素,2019/5/31,23,牛奶中的四环素,2019/5/31,24,四环素食品分析的结果,化合物 牛肉 猪肉 牛奶 牛奶 0.5 g/ g 0.5 g/ g 25 g/L 50 g/
9、L4 土霉素 96.2 (5.7) 103 (5.0) 70.7 (3.5) 67.7 (5.8) 四环素 91.4 (5.5) 99.8 (6.1) 73.7 (7.3) 68.5 (5.1) 金霉素 80.6 (6.8) 83.4 (6.1) 76.7 (2.9) 67.3 (1.8） 结果以% 回收率表示,括号内数字为% RSD,2019/5/31,25,反相离子交换双重机理吸附剂,MCX：阳离子交换反相吸附剂 用于碱性物质提取 MAX：阴离子交换反相吸附剂 用于酸性物质提取 WCX：弱阳离子交换反相吸附剂 用于强碱性物质 (如季铵盐类)提取 WAX：弱阴离子交换反相吸附剂 用于强酸性物
10、质提取,2019/5/31,26,适合于碱性药物提取的MCX 小柱,2019/5/31,27,双机理吸附剂：碱性化合物的保留,2019/5/31,28,混合机理:阳离子交换与反相的保留,2019/5/31,29,MCX SPE 通用方法,2019/5/31,30,常见兽药残留的 SPE 推荐方法,名称 规格 克仑特罗 MCX/SCX/PCX 沙丁胺醇 MCX/SCX/PCX 磺胺 C18/PEP/ Alumina B 氯霉素 C18/PEP/Silica 氟喹诺酮 PEP/C18 硝基咪唑类药物 PEP/C18 己烯雌酚 PEP/C18 四环素 PEP/C18 莱克多巴胺 Alumina A/
11、 MCX,2019/5/31,31,SPE在残留分析方面的成功实例,硝基咪唑类药物： J AOAC International, 2003, 86(3), 505-509 四环素: J chromatography A, 2003,987,227-233 动物组织中盐酸克伦特罗的SPE与GC/MS 分析 液相色谱通讯，37，13-14,2019/5/31,32,SPE在残留分析方面的成功实例,莱克多巴胺： Analytica chim, 2003,483(1-2) P137-145 氯霉素： 动物源食品中氯霉素的液相色谱-质谱测定,分析测试学报，2002，21增刊，185-186 磺胺： 动物
12、组织中磺胺类药物残留量检测方法-HPLC法,2019/5/31,33,磺胺药物样品前处理SPE法,HLB 鸡组织中磺胺类药物残留量检验方法高效液相色谱紫外检测法 广州出入境检验检疫局食品检验处 B(碱性氧化铝小柱) 羊肉组织中七种磺胺残留的测定 Waters液相色谱通讯35期，2002年 动物源食品中磺胺类药物残留的检测方法高效液相色谱法 农业部号文 C18 高效液相色谱法测定肉类奶粉中四种磺胺药物残留量的方法研究 Waters液相色谱通讯15期，1990年 动物源食品中磺胺二甲嘧啶残留检测方法高效液相色谱法 农业部号文；,2019/5/31,34,典型成功开发：,动物组织中磺胺药物的残留检测
13、方法HPLC法 NY 5029-2001 农业部“无公害畜产品例行监测”专用方法 艾杰尔科技磺胺专用柱,2019/5/31,35,动物源食品中磺胺类药物残留检测方法 高效液相色谱法 简介,农业部畜禽产品质量监督检验测试中心,2019/5/31,36,主要内容,一、适用范围 二、原理 三、试剂和材料 四、仪器设备 五、检验步骤,2019/5/31,37,1、适用范围,本方法用于测定动物可食性组织中磺胺间甲氧嘧啶（SMM）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺甲噁唑（SMZ）、磺胺二甲氧嘧啶（SDM）、磺胺喹噁啉（SQ）单个或混合物的残留量。,2019/5/31,38,2原理,组织经乙腈提取后，其上清液
14、加入正己烷进行液液分配，取下层溶液加入正丙醇减压干燥，残留物用乙腈溶解，过Sep-Pak碱性氧化铝柱, 洗脱，干燥后定容，用高效液相色谱仪进行检测。,2019/5/31,39,3、试剂和材料,除特别注明外，所用试剂均为分析纯；水为超纯水。 3.1 磺胺类药物标准品（SMM、SDM、SM2、SMZ和SQ），（Sigma公司，含量不少于98.9%） 3.2 甲醇 色谱纯 3.3 乙腈 色谱纯 3.4 正已烷 3.5 正丙醇 3.6 无水硫酸钠,2019/5/31,40,3、试剂和材料,3.7 碱性氧化铝SPE柱（6毫升，500毫克） 3.8 磺胺类药物标准储备液（1mg/mL） 分别精密称取上述磺
15、胺类药物标准品各50mg，甲醇溶解并转移到50mL容量瓶，定容，摇匀。置-20以下冰箱中保存,有效期3个月。 3.9 磺胺类药物标准工作液 取磺胺类药物标准储备液用流动相稀释成浓度为0.05,0.1,0.2,0.5,1.0，2.0g/mL的标准工作液。置2-8冰箱中保存，有效期1周。,2019/5/31,41,4、仪器设备,4.1 高效液相色谱仪（配紫外检测器） 4.2 离心机 4.13 固相萃取装置（配考克阀） 4.4 分析天平 精度0.0001g 4.5 天平 精度0.01g 4.6 旋转蒸发仪 4.7 振荡器 4.8 匀浆机 4.9 涡动混合器 4.10 分液漏斗 50mL 4.11 梨形瓶 100mL 4.12 离心管 50mL 4.13 微孔滤膜 0.45m,2019/5/31,42,5 检验步骤,5.1 试料的制备 5.1.1 取绞碎后的供试样品,作为供试试料。 5.1.2 取绞碎后的空白样品,作为空白试料（阴性对照）。 5.1.3 取绞碎后的空白样品5g,添加5g/mL的工作液0.1mL，作为空白添加试料（阳性对照）。,2019/5/31,43,5 检验步骤,5.2提取和纯化 5.2.1 组织样品5.00g5g
