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1、1应用变性高效液相色谱技术检测肥大细胞病 c-kit 基因突变作者：张凌岩,徐功立,NicholasC.P.Cross1【摘要】本研究检测 7 例肥大细胞病患者 c-kit 基因激酶编码区突变情况，以探讨该基因变异在肥大细胞病诊断及治疗中的意义。应用 PCR 测定、变性高效液相色谱技术及 DNA 测序方法对患者进行 c-kit 基因外显子 17外显子 19 突变检测。结果表明：1 例患者外显子 17 扩增产物在 DHPLC 中出现异常色谱峰，测序结果显示在外显子 17 出现 AT 突变，即 D816V；另 2 例患者外显子 18/19 经DHPLC 检测，结果显示 1 个额外的色谱峰，测序结果
2、证实在外显子 18 出现 GC改变，为同义突变 L862L。结论：变性高效液相色谱技术是一种高效、可靠的突变检测方法，c-kit 基因突变检测对肥大细胞病临床治疗有指导意义。【关键词】变性高效液相色谱；c-kit 基因突变；D816V；L862L；肥大细胞病ApplicationofDenaturingHighPerformanceLiquidChromatographytoMutationDetectionofthec-kitGeneinMastocytosisAbstractTheaimofstudywastodetectmutationoftyrosinedomainofc-kitgen
3、einmastocytosisusingdenaturinghighperformanceliquidchromatographytechnique,andtoinvestigatethesignificanceofthisgenemutationindiagnosisandtherapyofmastocytosis.GenomicDNAwasobtainedfrombonemarroworperipheralbloodleukocytesusingthephenol/chloroformmethodfrom7mastocytosispatients.PCRwasperformedwithAm
4、pliTaqGoldDNApolymeraseand100nggenomicDNAtoamplifytheentirecodingsequenceandexon-intronboundariesofc-kitexon17exon19.Denaturinghigh-performanceliquidchromatography(DHPLC)analysiswasperformedonaWAVEDNAFragmentAnalysisSystem.EachPCRproductwasmixedwithanequalquantityofamplifiedhumanplacentalDNA(serveda
5、snormalcontrol)andwasdenaturedat95for5minutes,followedbyslowlycoolingdowntoroomtemperatureby1.5perminutetoallowheteroduplexesformation.AlltheconditionsfortheDHPLCanalysis,includingmeltingtemperatureandbuffergradientsweredeterminedusingtheTransgenomicsoftwareNavigator.Sampleswithextrapeaksorwithdiffe
6、rentpeakformonDHPLCweredirectlysequencedusingtheBigDyeTerminatorCycleSequencingReactionkitandABI3100GeneticsAnalyser.TheresultsshowedthatDHPLCrevealedanaberrantpeakinonepatientinexon17andtheD816Vmutationwasidentifiedbydirectsequencing.Theothertwopatientshadanextrapeakforexon18/19anddirectsequencingr
7、evealedaconservativesequencechange(L862L)withinexon18.Itisconcludedthatdenaturinghighperformanceliquidchromatographyisahighefficiencyandre2liabletechniqueformutationdetectionofc-kitgeneandthedetectionresultswouldbehelpfulfortheselectionoftherapyinmastocytosis.Keywordsdenaturinghighperformanceliquidc
8、hromatography;c-kitgenemutation;D816V;L862L;mastocytosis肥大细胞病是指体内肥大细胞异常增生的一种疾病，包括皮肤型肥大细胞病、系统性肥大细胞病、肥大细胞肉瘤及肥大细胞白血病等数种类型。系统性肥大细胞病（systemicmastcelldisease,SMCD)以全身多器官组织中肥大细胞浸润及增生为特征，少数患者可在慢性 SMCD 的基础上发生肥大细胞白血病。原癌基因 c-kit 的编码产物 c-kit 蛋白是干细胞/肥大细胞生长因子的受体（stem/mastcellgrowthfactorreceptor)，在肥大细胞的生长发育中有重要作用
9、。c-kitD816V 突变，即发生在外显子 17 的腺嘌呤胸腺嘧啶点突变，导致肽链 816 位点的天冬氨酸（D）被缬氨酸（V）代替，是成人散发性肥大细胞病的特征和主要病因，发生于大约 60%的患者1 。以往对该病无特效治疗方法，近年来部分肥大细胞病患者经信号转导抑制剂伊马替尼治疗后获得了良好效果，但有 D816V 突变的患者则对伊马替尼耐药2 。故检测肥大细胞病的 c-kit 基因突变对于选择治疗方案、判断预后有重要意义。我们用变性高效液相色谱技术(denaturinghighperformanceliquidchromatography，DHPLC)对 7 例系统性肥大细胞病患者的 c-k
10、it 基因外显子 17-19 全长进行突变扫描，以确定 D816V 的发生率，预测患者对伊马替尼的疗效，并在这 3 个编码激酶区的外显子中检测是否有其他的突变。材料和方法病例7 例系统性肥大细胞病患者系英国 Hammersmith 医院及 Bartholomew 医院患者。男 4 例，女 3 例，中位年龄 48 岁（29-74 岁） 。DNA 提取标本取自患者骨髓 2ml 或外周血 5ml，常规酚/氯仿法提取基因组 DNA，于-20保存备用。突变检测应用 DHPLC 技术进行突变检测。DHPLC 技术是近年来用于筛选 DNA 结构变异的一项新技术，其原理是：在 DNA 部分变性情况下，当流动相
11、缓冲液 B 中的乙腈3梯度增加时，有错配的异源双链会早于同源双链从 WAVE 系统的固定相中被洗脱出来而被紫外检测系统检测到异常的色谱峰。但如果突变是纯合子或半合子，则无法形成异源双链。所以我们将所有待测样本分别与野生型的正常人胎盘DNA（Sigma 公司产品）等量混合后变性及缓慢复性，若待测 DNA 中有突变存在，将在复性时形成自身同源双链的同时与正常 DNA 形成异源杂合双链，进而显示出异常的色谱峰。引物设计与合成各引物序列均选在内含子部位且距剪接点 40-60bp 以保证扩增全长待测外显子及剪接区域，因内含子 18 较短，故外显子 18、内含子 18 及外显子 19 使用 1 对引物同时
12、扩增。引物由美国 Sigma 公司合成。引物序列如下：外显子 17：上游 5-GTGAACATCATTCAAGGCGT-3；下游 5-GTGTGATATCCC-TAGACAGG-3。外显子 18/19：上游 5-GCAACAGCAGCATCTATAAG-3；下游 5-ACCCTCAACATCTGGGTTTC-3。基因组 DNA 扩增反应体系为 75l，组成为：上游及下游引物(100pmol/l)各0.375l，dNTP(20mmol/L)0.75l，10缓冲液 7.5l，AmpliTaqGoldDNA 聚合酶(5U/l)0.375l，DNA100ng,MgCl2(25mmol/L)4.5l。P
13、CR 条件为：95预变性 5 分钟；94变性 1 分钟，外显子 1758退火 1 分钟、外显子 18/1962退火 1 分钟，72延伸 1 分钟，扩增 33 个循环；最后 72延伸 10 分钟。扩增产物长度外显子 17 为 412bp，外显子 18/19 为 495bp。取扩增产物 5l1.5%琼脂糖凝胶 100V 电泳 30 分钟，溴化乙锭染色，紫外分析成像系统观察电泳结果并打印。DHPLC 检测将上述扩增后的患者 DNA20l 分别与人胎盘正常对照 DNA20l混合，95变性 5 分钟，然后缓慢复性（每分钟降低 1.5至室温） 。之后将各待测样本置于 WAVE 色谱仪（Transgeno-
14、mic 公司产品，美国）的 96 孔板上，输入 DNA 序列；根据软件 Navigator（Transgenomic）的提示选择最佳运行温度：外显子 17 为 56及 57，外显子 18/19 为 58及 60，在该运行温度下 DNA片段的 1%-50%将解旋形成单链 DNA（即 DNA 部分变性） 。流动相的组成为缓冲液A：100mmol/LTEAA(三乙铵乙酸酯，triethylammoniumacetate)，pH7.0，0.1mmol/LEDTA(色谱纯)；缓冲液 B：100mmol/LTEAA 及 25%乙腈(acetonitrile)，pH7.0，均为美国 Transgenomic
15、 公司产品。最佳缓冲液梯度亦由软件 Navigator 设定：外显子 17 缓冲液 B 起始含量为 57.3%，外显子 18/19缓冲液 B 起始含量为 58.5%；每分钟缓冲液 B 含量提高 2%以形成缓冲液梯度，梯度形成时间为 4 分钟。设定每份标本进样量为 8l，以流速为 0.9ml/min 运行样本，分离柱保留时间为 6.3 分钟。另取人胎盘 DNA40l 做为阴性对照。紫外线检测波长为 260nm，运行结果在色谱仪上显示并打印。对显示异常色谱峰的样本将进行 DNA 序列测定。测序应用BigDyeTerminatorSequencingKitVersion3.1（ABI，FosterC
16、ity，CA，USA）进行双向 DNA 测序反应；反应产物应用 DyeEx2.0SpinKit 纯化。将纯化的 DNA 溶于10l 去离子甲酰胺中，然后置入 ABI3100DNA 测序仪中进行测序。数据分析软件为 DataCollectingSoftwareVersion1.1 及4SequenceNavigatorVersion1.0.1。结果1 例患者外显子 17 扩增产物 DHPLC 分析结果与对照标本比较显示一个异常的色谱峰，测序结果与 GenBank 上的序列(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)进行比较后显示其在外显子 17 出现 AT（腺嘌呤胸腺嘧啶）错义突变，相应的密码子由 GAC 变为 GTC，多肽链 816 位点的氨基酸由天冬氨酸改变为缬氨酸，即D816V（图 1A、B） ；另 2 例患者外显子 18/19 扩增产物 DHPLC 结果显示 1 个额外的色谱峰，测序结果证实在外显子 18 出现 GC（鸟嘌呤胞嘧啶）改变
