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1、1广东人 H5N1 毒株 PB2 基因进化和特性【摘要】目的：通过对人禽流感 H5N1 毒株 PB2 基因序列的变异分析，揭示毒株 PB2 基因特征与进化.方法：检测广东地区人禽流感 H5N1 毒株 PB2 基因核苷酸序列，同时检索全球人禽流感 H5N1 毒株 PB2 基因序列，采用 DNAStar5.0 软件对检索的人禽流感 H5N1 毒株 PB2 基因核苷酸序列进行比对和分析；并结合流行病学资料对变异毒株进行进化速度分析.结果：1997/200648 株毒株 PB2 基因核苷酸序列同源性分成两组，1997/1998 毒株为第一组(G1)，2003/2006 毒株为第二组(G2).PB2 基
2、因错义置换导致 101 个氨基酸位点变异，占比例13.3(101/759).PB2 基因 Ks 值为 39.410-663.410-6Nt/d，Ka 值为3.3610-65.1110-6Nt/d；提示 PB2 基因进化主要受到自发突变影响.2003/2006 毒株（包括毒株 GD0106 ）仅保留一个糖基化位点（NPT301303 ） ，丢失 3 个糖基化位点，可能影响蛋白致病性和抗原性.结论：目前 PB2 基因进化分成两组，主要受到除自发突变影响；PB2 基因丢失 3 个糖基化位点可能影响蛋白致病性.人禽流感 H5N1 毒株 PB2 基因在自然界变异非常频繁，不断变异将影响H5N1 毒株在人
3、 人传播能力和引发大流行.【关键词】人禽流感 H5N1 毒株 PB2 基因进化特性0 引言人禽流感 H5N1 感染正在全球蔓延，199704/200701, 全球 11 个国家和地区（中国香港、阿塞拜疆、柬埔寨、中国大陆、吉布提、埃及、印尼、伊拉克、泰国、土耳其、越南）感染人禽流感 H5N1 病毒，横跨亚欧大陆；确诊病例 289例，死亡 170 例，合计病死率为 58.8%(170/289)；其病死率在急性传染病中已名列前茅.广东地区的首例病例出现于 200602 1.人禽流感 H5N1 毒株属于高致病性禽流感病毒(HPAIV)，聚合酶蛋白 B（PB）可分为 PB1 和 PB2，其中 PB2
4、由第 1 节段基因编码，对流感病毒感染性和致病性起作重要作用2-3.为了解人禽流感 PB2 基因的进化特征，我们对广东及世界各地人禽流感 H5N1 毒株的 PB2 基因序列的变异、抗原性、进化进行研究，以期对人禽流感控制和预防提供理论依据.1 材料和方法1.1 材料毒株 GD0106 由本实验室于 2006 年分离鉴定1 ；从 GenBank 和 LANL检索获得世界各地人禽流感 H5N1 毒株（52 株）的 PB2 基因序列2 ，包括HK48297 ，HK48197 ，HK48397 ，HK9798 ，HK15697 ，HK53297 ，HK53897 ，HK54297 ，HK21203 ，
5、HK21303 ，VN119404，VN120304 ，VNCL0104 ，VNCL2604 ，TL1604 ，TLSP8304，VN120404 ，VN306204 ，VNCL11505 ，VNDT03605 ，IDNS505，IDNSC705 ，IDNS160H05 ，IDNS175H05 ，IDNS245H05 ，TL67605 ，IDNS239H05 ，IDNSC59606 ，IDNSC61006 ，IDNSC62306，IDNSC62406 ，IDNSC69906 ，IDNSC74206 ，Iraq106 ，AZBJ00620706 ，Egpt90278206 ，Egpt902784
6、06 ，IDNSC35706 ，IDNSC39006 ，IDNSC73906 ，IDNSC83606 ，IDNSC93806 ，TK1206 ，IDNS6559606 ，IDNS65124206 ，ZJ1606 ，IDNS283H06 ，共 48 株；其中 1997/1998 毒株 8 株，2003 年毒株 2 株，2004 年毒株 8 株，2005 年毒株 92株，2006 年毒株 21 株.1.2 方法1.2.1 检测根据 2003/2005 东南亚地区人禽流感毒株 PB2 基因序列设计并合成扩增引物；PPB2F1:5TATTGGTCTCAGGAGCCAAAGCAGGTC3 ，PPB2R1
7、 ：5GGGGCTGTGCAAATGGTA3 ；PPB2F2 ：5ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT3，PPB2R2 ：5CCAGGCGGAGAAGTGAGAAA3. 对广东地区人禽流感毒株GD0106 采用 QIAGEN 公司 QIAampViralRNAminiKit 提取 RNA,进行 RTPCR 扩增；试剂分别采用 QIAGENSensiscriptReverseTranscriptase 和TaKaRaPyroBestTag.PCR 产物纯化采用 QIAGENGelExtractionKit，测序用ABIPRISMBigDyeTerminatorV3
8、.0ReadyReactionCycleSequenceKit，在ABIPRISM3100GeneticAnalyzer 上测序.用不同引物扩增同一基因片断，以检验测序序列的正确性.1.2.2 分析4-5对检测和检索的 PB2 基因核苷酸序列采用 DNAStar5.0 软件，进行逐一比对，并确定编码氨基酸序列.然后采用 DNAstar5.0 软件进行氨基酸变异和进化分析.计算 PB2 基因同义突变速度（Ks）和错义突变速度（Ka）值；同时根据生物统计学检验公式 Z（KaKs)/VKaKs1/2，判断是否存在选择作用.我们将来自 1997 年中国香港人禽流感 H5N1 毒株 HK48297 毒株
9、为比对基准.核苷酸中腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，简称为 A，G，C，T；20 种氨基酸也用各自缩写表示.2 结果2.1 一般情况毒株 GD0106(H5N1) 的 PB2 基因核苷酸为 2280 个，编码 759 个氨基酸(图 1)；A，T，G，C 比例分别为 33.2%，21.7%，26.1%，19.0%；G+C 比例占45.1.PB2 基因编码 225 个氨基酸构成比例依次为颉氨酸(V)亮氨酸(L)精氨酸(R)谷氨酸(E)丝氨酸(S)苏氨酸(T)异亮氨酸(I)甘氨酸(G)丙氨酸(A)赖氨酸(K)谷酰胺(Q)，蛋氨酸(M)天冬氨酸(D)天冬酰胺(N)脯氨酸(P)苯丙氨酸(F)酪氨酸(Y
10、)组氨酸(H)，色氨酸(W)半胱氨酸(C)，氨基酸序列如图 1 所示.以毒株 HK48297 为基准，PB2 基因共有 588 个核苷酸发生置换，占比例 25.8(558/2280)；其中 476 个核苷酸为同义置换，112 个核苷酸为错义置换，错义置换导致 101 个氨基酸位点变异，占比例 13.3(101/759).2.2 生物进化以毒株 HK48297 为基准（MRCA） ，毒株HK21303 ，VN120304 ，TL67605 ，GD0106 毒株 PB2 基因的 Ks 值分别为 63.410-6，52.610-6，45.110-6，39.410-6Nt/d；Ka 值分别为5.111
11、0-6，4.8710-6，4.7510-6，3.3610-6Nt/d.由于毒株HK21303 ，VN120304 ，TL67605 的 Ks 值均大于 Ka 值 9.512.4 倍，提示 H5N1 毒株的负选择作用的存在.根据生物进化检验公式 Z（KaKs）/VKaKs1/2,V 为方差，则 4 株毒株的 Z 值分别是：-0.960，-0.955，-0.948，-0.958；显示毒株 HK21303 ，VN120304 ，TL67605的 PB2 基因受到的感染宿主选择性作用不明显6.2.3 基因进化对 48 株毒株PB2 基因核苷酸序列进行同源性比较，发现毒株分成两个系列：1997/1998
12、 香港人禽流感毒株为一个系列（G1） ，2003/2006 毒株为另一个系列（G2）.在2003/2006 毒株（G2）中，2003 年中国香港毒株，2004/2005 越南，泰国毒株为3一组（G2a） ，2006 年土耳其，伊拉克，阿塞拜疆，埃及，中国浙江毒株为二组（G2b） ，2005/2006 印尼毒株为三组（G2c） ，2006 年中国广东毒株为四组（G2d）.48 株毒株 PB2 基因核苷酸序列同源性在 81.899.8之间，核苷酸差异最小和最大分别在 VNCL0104 和 VNCL2604 之间和 HK53297 和TK1206 之间.其中，1997/1998 香港人禽流感毒株（G
13、1）8 株中，PB2 基因核苷酸序列同源性在 98.099.5之间.2003/200640 株毒株（G2）中，PB2 基因核苷酸序列同源性在 90.299.8，其中 IDNSC93806 ，GD0106 毒株同源性为 90.2(图 2).2.4 氨基酸变异 48 株毒株中 PB2 基因共有 101 个氨基酸发生置换.1997/19988 株毒株与 2003/200640 株毒株的氨基酸位点比较，完全发生置换位点包括M147I/L，K194Q，N195D，N197K，V292I/T，F323L，K334S，F336S，M381L，M524T，E567D，S590G，A655V，T717A.G2a
14、 组中，发生置换 T105A，K339R；G2b 组中，发生置换 K526R，E730D；G2c 组中，发生置换 R368Q，I451T，V649I；从氨基酸位点发现，中国大陆浙江毒株 ZJ1606 和广东毒株 GD0106 有某种程度同源，但 GD0106 毒株（G2d）发生置换位点包括T081A，V344M，T559A，K586M.2.5 抗原位点变异毒株 HK48297PB2 基因拥有糖基化位点NIS197199 ，NPT301303 ，NKT659661 ，NLT715717 ，到 2006 年毒株仅保留糖基化位点 NPT301303 ；其中，1997/1998 毒株均有 NKT659
15、661 和NLT715717 糖基化位点，而 2003/2006 毒株均无；毒株HK48297 ，HK15697 ，HK53897 ，HK9798 拥有糖基化位点NIS197199 ，而其它毒株均无.48 株毒株中 PB2 基因 5 个半胱氨酸未发生改变.3 讨论流感病毒基因组 S1 节段编码 PB2 蛋白，组成 RNA 聚合酶的一部分；而此酶在自身复制过程中缺乏校正功能，所以流感病毒基因突变的发生频率很高，也包括 PB2 蛋白2.与人禽流感 H5N1 毒株核蛋白基因（NP）比较，PB2 基因进化有自身特点.NP 基因 Ks 值为 20.310-625.510-6Nt/d，Ka 值为 1.5810-63.1010-6Nt/d；而 PB2 基因 Ks 值为 39.410-663.410-6Nt/d，Ka 值为 3.3610-65.1110-6Nt/d.PB2 基因与 NP 基因比较，PB2 基因的同义突变速度高于 NP 基因同义突变速度，而 PB2 基因的错义突变速度也略高于 NP 基因错义突变速度；与 NP 基因比较，PB2 基因自发突变速度更快，而受到的免疫压力的突变更慢.对 48 株毒株 PB2 基因核苷酸序
