《【最新word论文】幽门螺杆菌ureB基因表达产物的反应原性【医学专业论文】》由会员分享，可在线阅读，更多相关《【最新word论文】幽门螺杆菌ureB基因表达产物的反应原性【医学专业论文】（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1幽门螺杆菌 ureB 基因表达产物的反应原性作者：秦立篷，李丁，张菊，韩锋产，阎小君【关键词】幽门螺杆菌关键词:幽门螺杆菌;尿素酶 B 基因;大肠杆菌摘要:目的克隆幽门螺杆菌 ureB 基因，并进行表达，验证表达产物的反应原性.方法应用 PCR 技术从临床分离株中扩增出 ureB 基因，克隆入载体 pGEM-7zf（+）进行测序，进一步转到大肠杆菌表达载体 pBV220 进行诱导表达，以Westernblot 实验验证重组蛋白的反应原性.结果测序后经同源性比较，证实扩增后得到的片断确为 ureB 基因，并原核表达出可被抗 Hp 抗体识别的非融合重组蛋白.结论获得了有反应原性的重组 UreB
2、蛋白.Keywords:Helicobacterpylori;ureaseBgene;E.coliAbstract:AIMTocloneandtoexpresstheureBgeneofHelicobacterpyloriandanalysethereactionogenicityoftherecombinantureB.METHODSH.pyloriureBfragmentswereamplifiedbyPCR，thentheDH5?wastransformedbypBV220/ureBaftersequencingandBLAST.Thereactiono-genicityoftherec
3、ombinantUreBwasdetectedbyWestern-blot.RESULTSH.pyloriureBfragmentsweresubse-quentlyclonedintotheprokaryoticexpressionvectorpBV220aftersequencing（Theresultshowedthat96%oftheDNAse-quenceswehadgotwerethesameasthatofM60398，sotheyweretherightgenewewanted）.ThentheDH5?wastrans-formedbypBV220/ureB，andtherec
4、ombinantproteinwasinducedbyheatwhentemperaturereached42.Themolec-ularmassoftheexpressedUreBwereconformedtothatweanticipated.TheformoftherecombinantUreBwereinclu-sionbodiesinhostbacteria.Western-blotshowedthattherecombinantUreBwasexpressedinDH5/pBV220/ureBwhichcouldberecognizedbyanti-H.pyloriantiseru
5、m.CONCLUSIONFragmentofureBisobtained，anditisex-pressedinE.coli.0 引言H.pylori（Hp）能特异地产生活性很强的尿素酶.Hp 尿素酶既是定植因子又是毒力因子1 ，有很强的抗原性2.据此特点，人们发展了血清学方法来诊断 Hp 感染3.Hp 不易培养，要获得大量的 Hp 蛋白，需要进行重组表达.我们选择了尿素酶 B 亚基进行重组表达，并验证表达产物的反应原性.21 材料和方法1.1 材料限制性内切酶（EcoR，Hind） ，TaqDNA 聚合酶、T4DNA 聚合酶、Rnase，DnaseI，低分子量蛋白 marker，DNAMar
6、ker（DL2000）购自宝生物工程有限公司.QIAquickGelExtractionKit 购自 Qiagen 公司.WizardPlusMilipresDNA 纯化试剂盒购自 Promega 公司.过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG，DAB 显色试剂盒购自博士德生物工程公司.羊 Hp 多克隆抗体购自 DAKO 公司.pGEM-7zf（+）质粒、pBV220 质粒、大肠杆菌 JM109，大肠杆菌 DH5 均由本所保存.Hp 临床分离株由第一军医大学周殿元教授、陈烨博士惠赠.1.2 方法以 Hp 临床分离株基因组 DNA 为模板，用 PCR 扩增 HpureB 基因.引物序列为引物 1:5-CC
7、CGCGGAATTCATGAAAAAGATTAGCA-GAAAAGAATAT-3，引物2:5-GCCAAGCTTT-TACATCGCTTGAGAGTCAGAACT-3.将扩增产物克隆入经 EcoR和 Hind双酶切后的 pGEM-7zf（+）载体，蓝白筛选后，再经 EcoR和 Hind双酶切鉴定后选取阳性克隆，命名为 pGEM-7Zf（+）/ureB-EH.由上海基康公司以全自动序列分析仪双向测定插入片段的序列，拼接出完整序列，进行 BLAST 分析.将 pGEM-7Zf（+）/ureB-EH 重组质粒用 EcoR和 Hind双酶切后，回收约1098bp 大小的基因片段，克隆入 pBV220
8、质粒相应的酶切位点，将以 EcoR和Hind双酶切筛选的阳性克隆命名为 pBV220/ureB-EH.挑取重组表达质粒pBV220/ureB-EH 转化的 E.coliDH5 菌株，用含氨苄青霉素的 LB 培养基按 1100倍稀释接种，30振摇到对数增长晚期，42诱导 5h.集菌后作 120gL-1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳以鉴定重组蛋白的分子量和表达形式.Westernblot 实验验证重组蛋白的反应原性，以空 pBV220 载体转化的 E.coliDH5 菌作为阴性对照.2 结果2.1HpureB 基因的克隆用 PCR 扩增 HpureB 基因，扩增出 1098bp 的基因片段，克隆入 p
9、GEM-7zf（+）后，经蓝白筛选和酶切鉴定出阳性克隆，测序及 BLAST 分析结果表明与报道的序列同源性为 96%，以该序列推导出的氨基酸序列与文献报道的完全相同（Fig1）.图 1 略2.2 重组表达质粒的构建 pGEM-7Zf（+）/ureB-EH 重组质粒用 EcoR和Hind双酶切后，回收长度约 1098bp 的基因片段，克隆入 pBV220 质粒相应的酶切位点，以 EcoR和 Hind双酶切筛选阳性克隆，酶切片段大小与预期相符，构建成功（Fig2）.2.3pBV220/ureBEH 的诱导表达诱导表达后集菌作 120gL-1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定分子量和表达形式.可见 34
10、.3ku 大小的蛋白表达（分子量与预期相符） ，主要以包涵体的形式存在于胞质中，诱导 4h 后表达量趋于稳定.Westernblot 证实重组蛋白具有反应原性（Fig35）.图 2图 4 略3 讨论3在 Hp 的致病过程中有多种致病因子参与，其中尿素酶被证实是少数几种与Hp 感染密切相关的蛋白，具有极高的尿素酶活性，是 Hp 重要的生物学特性之一7.Hp 尿素酶既是定植因子又是毒力因子，是 Hp 主要抗原之一.目前用裂菌提纯的尿素酶作为抗原的血清学诊断试剂盒已经商品化.血清学方法诊断 Hp 感染，其结果取决于所用抗原的种类和质量.尿素酶的亚单位 ureA 和 ureB 的表达产物均能诱导机体产
11、生免疫反应，但后者的反应性更强4.因此我们选择了 ureB亚基重组表达，并验证了表达产物的反应原性.图 5 略ureB 亚基是目前疫苗研究和诊断用品的重要抗原.ureB 的氨基酸序列非常保守，不会影响其作为诊断试剂的抗原.我们构建了 ureB 亚基重组表达载体pBV220/ureB-EH，目的在于获得大量可用于血清学诊断的重组蛋白.参考文献:1DunnBE，CohenH，BlaserMJ.HelicobacterpyloriJ.ClinMicrobiolRev，1997;10:720-741.2SprengS，GentschevI，GoebelW，MollenkopfH，EckM，Muller
12、-HermelinkHK，SchmausserB.Identificationofim-munogenicantigensofHelicobacterpyloriviatheEscherichiacolihemolysinsecretionsystem（1） J.FEMSMicrobiolLett，2000;186（2）:251-256.3LeungWK，ChowTP，NgEK，ChanFK，ChungSC，SungJJ.ValidationofanewimmunoblotassayforthediagnosisofHeli-cobacterpyloriintheAsianpopulationJ.AlimentPharmacolTher，2001;15（3）:423-428.4Gomez-DuarteOG，LucasB，YanZX，PanthelK，HaasR，MeyerTF.ProtectionofmiceagainstgastriccolonizationbyHelicobacterpyloribysingleoraldoseimmunizationwithatten-uatedSalmonellatyphimuriumproducingureasesubunitsAandBJ.Vaccine，1998;16（5）:460-471.
