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1、几种测定抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）的方法1浊度法1.1常量肉汤稀释法（试管）1.1.1.抗菌药物贮存液制备将抗菌肽稀释到无菌水中，制成1024g/ml的原液，（也可以用0.22um滤膜进行过滤，但要去掉前面5 ml的过滤抗菌肽溶液）。抗菌药物贮存液浓度按照不同梯度稀释。1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。1.1.3.培养基推荐使用LB肉汤培养基，pH7.07.4。指示菌为大肠杆菌或沙门氏菌。1.1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4
2、-5ml的LB肉汤中，35孵育2-6 h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或LB肉汤培养基校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含12108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，推荐直接取培养1824 h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用LB肉汤将上述菌悬液进行1100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。 1.1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种取无菌试管（13100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6ml LB肉汤外，其余每管加入LB肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1024g/ml）0.4ml混匀，
3、然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25g/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125g/ml。（注：在稀释的过程中，每次吸取1ml到下一管中后，要换掉枪头，后面的方法相同）1.1.6.孵育将接种好的稀释管塞好塞子，置37摇床培养1620h。1.1.7.结果判
4、断与解释在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。或者用分光光度计测定OD600，与未接菌的比对，判断耐药（resistant,R）、敏感(susceptible,S)或中介（intermediate,I）。1.2.微量肉汤稀释法（酶标板）1.2.1.抗菌药物和培养基制备同常量肉汤稀释法。1.2.2.MIC板制备无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔10
5、l，药物浓度分别为1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25g/ml。第12孔不加药作为生长对照，如果当时不使用，则冰冻干燥后密封，-20以下保存备用。1.2.3.接种物制备将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经LB肉汤11000稀释后，向每孔中加90l，密封后置37摇床孵育1620h判断结果。此时，第1孔至第11孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125g/ml。1.2.4.结果判断以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC（用酶标仪测得OD600）。当阳性对照孔（即不含抗菌
6、肽）内细菌明显生长试验才有意义。当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。通常对革兰阴性杆菌而言，微量肉汤稀释法测得的MIC与常量肉汤稀释法测得的结果相同或低一个稀释度（1孔或2倍）。2. 琼脂稀释法2.1 琼脂稀释法：琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌肽药物，加入融化并冷至50左右的定量MH或LB琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。2
7、.1.1培养基和抗菌肽原液制备使用LB琼脂，pH7.27.4。按照倍比稀释法，分别配制12800、6400、3200、1600、800、400、200、100、50、25、12.5ug/mL的抗菌肽原液（如采用90%的抗菌肽，可以从3200ug/mL进行稀释）。2.1.2含抗菌肽琼脂平板制备将配制好的LB液体培养基放入12个50mL三角瓶中，每个小三角瓶20ml液体培养基，每个三角瓶加入0.2g琼脂粉，纱布封口后高压灭菌。灭菌后，冷却至并在5055（或至于该温度水浴中），每个三角瓶培养基中加入200uL的抗菌肽原液，并设置一个对照（不加入抗菌肽原液），则三角瓶中的培养基抗菌肽浓度为128、64
8、、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0ug/mL。充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度34mm。2.1.3.接种物制备与接种制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再110稀释，以微量取液器将制备好菌液（约12l）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU/mL，形成直径为58mm的菌斑。接种好后置37孵育1620h，观察结果。2.1.4.结果判断 将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。 如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度
9、或重复试验。2.2 琼脂打孔法：2.2.1 如前面所示，配制256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25g/ml的抗菌肽溶液。2.2.2按照抑菌圈的操作方法制作抑菌圈（1） 菌种活化 将甘油菌平板划线后，用牙签挑取单菌落放入装有5 mL LB 液体培养基的管试中，并于摇床内37、200 rpm振荡培养12h，后存放于4冰箱，备用。 （2） 于超净工作台内，向每个灭菌培养皿中倾注10 mL-15 mL 的高压灭菌过的素琼脂（1.5%琼脂）进行铺底，每个培养皿厚度均一，待素琼脂冷却凝固后，备用。（3） 吸取20 L-30 L指示菌菌液加入到100 mL 恒温至505的LB固体
10、培养基中，轻轻摇匀（避免起泡）。（4） 将上述加过菌液的固体培养基倒入铺过素琼脂的培养皿中，每个平皿倒5-7mL，该层一定要均匀铺平，待其冷却凝固。 （5） 用镊子夹取牛津杯放在制好的抑菌圈培养皿内，并在培养皿外延做好标记。吸取150 L的待检样样品注入到相应的牛津杯内，同时设立灭菌水为空白对照。（6） 将培养皿移入37 培养箱培养。在接下来的6-12 h 内观察菌体的生长情况及抑菌效果，一般8-12小时即可观察到抑菌圈，但是不同指示菌及每次铺制平板操作的不同，会有差别，要及时观察。 2.2.3.结果判断 观察平板中的抑菌圈直径，同时用无菌水作为对照，判断最小抑菌浓度。例如：无菌水的直径为9m
11、m，稀释0.25g/ml浓度时抑菌圈直径为9mm，而0.5g/ml浓度时抑菌圈直径为11mm，则可判断其最小抑菌浓度为0.5g/ml。3. E试验（E-test） E试验是指浓度梯度琼脂扩散试验，其原理基本同扩散法，即浓度呈连续梯度的抗菌药物从塑料试条中向琼脂中扩散，在试条周围抑菌浓度范围内受试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。E试验综合了稀释法和扩散法的原理和特点，同时还弥补了二者的一些不足，可以像稀释法一样直接定量测出抗菌药物对受试菌的MIC。 3.1.培养基、菌液制备和接种 同纸片扩散法。 3.2.贴E试验条 同纸片扩散法，E试验条的刻度面朝上，不得贴反，一旦接触琼脂后不得再移动。直径150mm的平皿内可放置6根E试验试条，90mm者一般只能放置1根。 3.3.孵育时间和温度 同纸片扩散法。 3.4.结果阅读 孵育后围绕试条可形成一个椭圆形的抑菌圈，在抑菌圈和试条的横切相交处试条上的读数刻度即是测定抗菌药物对受试菌的MIC。阅读时应注意的问题见供应商的产品说明书。
