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1、乳糖操纵子的诱导原理,中心法则(the central dogma),基因表达(gene expression)-基因转录及翻译的过程。产生各种RNA(tRNA、mRNA、rRNA)和各种蛋白质多肽链。 RNA(tRNA、mRNA和rRNA,基因的表达方式 根据生物对内外环境刺激的反应，将基因表达的方式分为： 组成型表达 诱导和阻遏表达,相关定义,组成型表达 （constitutive gene expression）,在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中持续进行的基因表达，无论表达的水平高或低，它受环境因素的影响较少、或变化很小。 且基因表达产物通常是对生命过程必需的、必不可少的，这类基因
2、通常被称为持家基因（housekeeping gene）。,相关定义,诱导和阻遏表达,诱导（induction）：在特定的环境信号刺激下，相应基因被激活，从而使基因的表达产物增加。这类基因称为可诱导基因。 可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导 (induction)。 乳糖 利用乳糖的三种酶表达 阻遏（repression）：在特定环境信号刺激下，相应基因被抑制，从而使基因的表达产物减少。这类基因称为可阻遏基因。 可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏 (repression）。,相关定义,协调表达 (coordinate expression),在一定机制控制下，功能上相关的一组
3、基因，无论其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达，使各表达产物的分子比例适当，从而正常发挥功能。这种现象称为协调表达 (coordinate expression)，这种调节称为协调调节 (coordinate regulation)。,相关定义,乳糖操纵子的结构和功能,操纵子模型的提出 1960-1961年，莫洛(Monod)和雅各布(Jacob)首次提出“操纵子”学说。 获1965年诺贝尔生理学和医学奖 1940年， Monod发现：细菌在含葡萄糖和乳糖的培养基上生长时，细菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源转变期，细菌的生长会出现停顿。即产生“二次生长曲线”。 操纵子（op
4、eron)：很多功能相关的结构基因串联排列在染色体上，由一个共同的控制区来操纵这些基因的表达，包含这些结构基因和控制区的整个核苷酸序列就称为操纵子。,操纵子的组成： -结构基因(structural gene, SG) ：操纵元中被调控的编码蛋白质的基因 -启动子(promoter，P)：是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。 -操纵基因(operator，O)：是指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列。 阻遏物基因(inhibitor,I),产生阻遏物(repressor)。,乳糖操纵子的结构和功能,三个特异性序列： 操纵序列 O (operator): 阻遏蛋白结
5、合位点。 启动子 P (promoter): 位于结构基因的上游。 CAP结合位点：环cAMP受体蛋白(分解代谢物激活蛋白)结合位点。 一个调节基因 lac I：编码阻遏蛋白，能结合于操纵序列位点。,乳糖操纵子的结构和功能,结构基因 Z编码-半乳糖苷酶：将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。 Y编码-半乳糖苷透过酶：使外界的-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。 A编码-半乳糖苷乙酰基转移酶：乙酰辅酶A上的乙酰基转到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。,乳糖操纵子的结构和功能,当一个mRNA含有编码一个以上蛋白质的编码信息，而且这些蛋白质都是以独立的多肽被翻译时，这样的mRNA称之多顺
6、反子mRNA。 多顺反子mRNA在细菌中是很普遍的。 多顺反子lac mRNA中的lacZ，lacY，lacA经翻译生成的产物分别生成代谢分解乳糖的三种酶 始终存在着一定的比例关系( Z : Y : A = 5 : 2 : 1 ),乳糖操纵子的结构和功能,乳糖操纵子的结构和功能,lacZ、Y、A基因的转录是由lacI基因指令合成的阻遏蛋白R所控制。lacI一般和结构基因相毗连，但它本身具有自己的启动子和终止子，成为独立的转录单位。 由于lacI的产物是可溶性蛋白，按照理说是无需位于结构基因的附近。它是能够分散到各处或结合到分散的DNA位点上。,乳糖操纵子的结构和功能,阻遏蛋白的负调控 (neg
7、ative control of repressor),阻遏蛋白的负调节(negative control of repressor) 无乳糖(no lactose): lac操纵元处于阻遏状态(repression) 有乳糖(presence of lactose)：lac操纵元即可被诱导(derepression,induction) 诱导剂(inducer): 别乳糖、半乳糖、IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）,The Lac Operon: When Glucose Is Present But Not Lactose,RNA Pol.,Come on, let me through,No
8、 way!,The Lac Operon: When Lactose Is Present But Not Glucose,Lac,This lactose has bent me out of shape,Yeah!,RNA Pol.,乳糖操纵子的调控机理,乳糖操纵子诱导物,别乳糖(allolactose)是诱导物,为什么选用IPTG作诱导物？,能诱导酶的合成，但又不被分解的分子,称为安慰诱导物（gratuitous inducer）。 由于乳糖虽可诱导酶的合成，但又随之分解，产生很多复杂的动力学问题，因此人们常用安慰诱导物来进行各种实验。 X-gal（5-溴-4-录-3-吲哚-半乳糖苷）也
9、是一种人工化学合成的半乳糖苷，可被半乳糖苷酶水解产生兰色化合物，因此可以用作 半乳糖苷酶活性的指示剂。IPTG和X-gal都被广泛应用在分子生物学和基因工程的工作中。,为什么选用IPTG作诱导物？,某些诱导物与自然的-半乳糖苷酶相似，且不能被酶分解，比如异丙基-D-硫代半乳糖苷，（isopropylthiogalactoside,IPTG）。不被细菌分解性质稳定，它的浓度在实验中不会改变。 复杂的动力学问题，便于研究。 IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被运送。,为什么选用IPTG作诱导物？,乳糖（葡萄糖-1，4-D-半乳糖苷）,半乳糖苷键中用硫代替了氧，失去了水解活性，但硫代半乳糖苷和同
10、源的氧代化合物与酶位点的亲和力相同，IPTG虽不为-半乳糖苷酶所识别，但它是lac基因簇十分有效的诱导物。,乳糖操纵子的CAP正调控 （Positive Control of CAP）,CAP(catabolite activator protein) -分解代谢基因激活蛋白 又称为 CRP (cAMP receptor protein), lac operon高水平转录必需的一个激活蛋白。 CAP(同二聚体),含 DNA结合区 以二聚体的方式与特定的DNA序列结合 cAMP结合区与cAMP特异结合，并发生空间构象的变化,形成cAMP-CAP复合物（有活性）,乳糖操纵子的CAP正调控 （Pos
11、itive Control of CAP）,当CAP与CAP结合位点这段序列结合时，可激活RNA转录酶活性，使之提高50X 葡萄糖 降解产物 ATP cAMP 5AMP CRP（非活性状态） CAP（活性状态）,乳糖操纵子的CAP正调控 （Positive Control of CAP）,无葡萄糖，cAMP浓度高时 促进转录,有葡萄糖，cAMP浓度低时 不促进转录,乳糖操纵子的CAP正调控 （Positive Control of CAP）,葡萄糖效应：当细菌在含有葡萄糖套和乳糖的培养基中生长时，通常优先利用葡萄糖。只有当葡萄糖消耗完，经过一段停滞期，在乳糖的诱导下半乳糖苷酶开始合成，细菌才能
12、充分利用乳糖。 葡萄糖的降解物能抑制腺苷酸环化酶活性，并活化磷酸二脂酶，因而降低 cAMP的浓度。 所以葡萄糖存在时，cAMP浓度低；仅在葡萄糖消耗完毕时, cAMP浓度增高，CAP-cAMP 复合物形成（结合于lac operon CAP结合位点)，才会促进转录。,乳糖操纵子的协调调控 (coordinate regulation),由于Plac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻遏使lac操纵元转录开放，还不能使细菌很好利用乳糖，必需同时有CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。 关键条件：lac操纵元的强诱导既需要有乳糖的存在又需要没有葡萄糖可供利用。,Lac操纵子基因表达
13、受阻遏蛋白和CAP的双重调控,The Lac Operon: When Lactose Is Present But Not Glucose,Lac,This lactose has bent me out of shape,Bind to me Polymerase,Yeah!,RNA Pol.,The Lac Operon: When Neither Lactose Nor Glucose Is Present,Bind to me Polymerase,RNA Pol.,STOP Right there Polymerase,Come on, let me through !,Lac操纵
14、子基因表达受阻遏蛋白和CAP的双重调控,负调节与正调节协调合作 阻遏蛋白封闭转录时，CAP不发挥作用 如没有CAP加强转录，即使阻遏蛋白R从P上解聚仍无强大转录活性 葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌优先利用葡萄糖 葡萄糖可降低cAMP浓度，阻碍其与CAP结合从而抑制转录,生物学意义,适应环境 （环境中的营养供给时刻可能发生变化。细菌等原核生物，还有部分单细胞真核生物就必须对环境的改变做出迅速的反应，以适应不同的代谢底物） 维持个体生长发育与分化,？,操纵子在非诱导状态，基因没有表达，也就不存在透性酶，那诱导物是如何进入细胞的？,本底表达,在细胞中透性酶等总是以最低量存在着，足以供给底物开始进入时的需要。也就是说，操纵子有一个本底水平（basal level）的表达，即使没有诱导物的存在，也保持此表达水平（诱导水平的0.1%）；有的诱导物是通过其他吸收系统进入细胞的。,小结,Lac操纵子基因表达受阻遏蛋白和CAP的双重调控。 lac操纵子中的一组基因有两道控制开关，只有两道开关同时打开时，即满足缺乏葡萄糖并存在乳糖条件时，基因才能够转录。,
