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1、实验方案 小鼠皮肤组织HE染色和免疫荧光染色 HE染色 一 试剂及耗材小鼠皮肤细胞，固定液（4%多聚甲醛），PBS,不同浓度乙醇，透明剂（二甲苯），石蜡，包埋盒，苏木精伊红染色液，中性树胶等二 实验步骤1.取小鼠皮肤组织去毛处理成合适的大小并置PBS或生理盐水中充分漂洗残余血液2.将漂洗干净的组织放入4%多聚甲醛中（1:5的比例浸泡）固定过夜3.将固定好的组织用PBS清洗两遍，每次30min4.组织脱水：30%乙醇50%乙醇75%乙醇（可4过夜）85%乙醇95%乙醇100%乙醇（各30min）5.透明：二甲苯透明320min（具体时间根据透明程度来设定，小鼠皮肤10min即透明，透明时如发现组
2、织有部分白雾状，则可能是脱水未脱净）6.浸蜡：430min（每30min换一次蜡，换四次以使石蜡浸入组织起支持作用）7.包埋（注意组织摆放及横切，纵切，记录标签），待石蜡充分凝固即可修片(刚包埋好的热蜡块不能立即冷冻)8.切片（5-7um），摊片（40-45），烘片（62左右，充分烘干）9.HE染色：二甲苯(10min) 二甲苯(5min) 二甲苯:乙醇=1:1(2min)100%乙醇95%乙醇(2min)85%乙醇(1min)70%乙醇(1min)50%乙醇(1min)水(1min)苏木精染液(1min)流动自来水(3min)50%乙醇(1min)70%乙醇(1min)85%乙醇(1min)
3、95%乙醇(1min)伊红染液(1min)95%乙醇(1min)100%乙醇(1min)100%乙醇(1min)二甲苯(2min)二甲苯(2min) 10.中性树胶封片(注意材料上的二甲苯不能干，尽量避免出现气泡)11.显微镜观察三 实验样品实验编号实验时间实验动物年龄实验动物性别取组织部位A2015.4.1-2015.4.38周母耳朵B2015.4.2-2015.4.44周公腹部C2015.4.3-2015.4.54周公背部四 实验结果免疫荧光染色一 试剂及耗材小鼠皮肤细胞石蜡切片，山羊血清，一抗，二抗，0.3%Triton x100，PBS等二 实验步骤1.石蜡切片60烘片1小时2.脱蜡到
4、水:二甲苯(10min) 二甲苯(5min) 二甲苯:乙醇=1:1(2min)100%乙醇95%乙醇(2min)85%乙醇(1min)70%乙醇(1min)50%乙醇(1min)水(1min)3.蒸馏水洗1min4.抗原修复：切片置于0.1mol/L且ph=6.0的柠檬酸钠修复液中，在水浴锅内（99）持续放10-15min，自然冷却20-30分钟（不能将切片拿出冷却）5.去除内源性酶：3%H 2O2室温孵育5-10min6.PBS洗2-3次，每次5min7. 0.3%Triton x100室温孵育20min（增加细胞膜通透性）8.于室温湿盒内非特异血清封闭1h,(用DPBS稀释含10% goa
5、t FBS)9.孵育一抗(ITGB1)4过夜或371h（一抗：DPBS(10% goat FBS)=1:200）,注意做空白对照（不加一抗，用DPBS(10% goat FBS)孵育）10. 孵育完成后PBS洗3次，每次5min11.滴加荧光二抗（IgG-FITC：DPBS(10% goat FBS)=1:200）室温置湿盒中避光孵育2小时或37 30min，用PBS 3分钟3次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS12.滴加DAPI 避光孵育2分钟（染核）。用PBS 1分钟3次洗去DAPI，用滤纸擦去标本外的PBS13.最后用含10%甘油PBS封片，并在荧光显微镜下立即观察备注：0.1mol/L 柠檬酸钠PH6.0(柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g加入1000ml蒸馏水中)
