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1、免疫分子及其在虾免疫系统中关键作用的发现Anchalee Tassanakajon，Kunlaya Somboonwiwat，Premruethai Supungul，Sureerat Tang摘要：在对虾中已经发现一些免疫相关分子，并且大部分是通过分析表达序列标签、基因芯片的研究核蛋白组学的方法发现的。这些免疫分子包括抗菌肽、丝氨酸蛋白酶和抑制剂、酚氧化酶、氧化酶、凝固蛋白、模式识别蛋白、凝集素、Toll受体及其他可能参与虾先天免疫系统的液体因子等。这些分子主要存在血淋巴和血细胞中（免疫反应主要发生的场所），在其他免疫器官或组织中也发现了一些，如淋巴器官、鳃、肠道等。虽然已经证明一些免疫分子
2、参与虾天然免疫系统中防御入侵病原体的反应，但是许多分子的功能仍不清楚。本文总结了现阶段我们关于对虾中免疫分子的发现及功能描述的知识。关键词：斑节对虾、先天免疫、免疫分子1. 介绍 对虾包括一些重要经济和海洋水产养殖品种，如凡纳滨太平洋白对虾、斑节黑虎对虾，是目前两个主要的全球养殖成功的物种。然而，疾病暴发造成了巨大的死亡率和对虾养殖业的重大损失，特别是虾主要病原体如白斑综合增病毒（WSSV）、黄头病毒（YHV）、传染性肌肉坏死病毒（IMNV）及细菌属中的弧菌等的爆发1,2。了解虾对入侵微生物的先天免疫反应为建立有效的控制上述病源爆发及新出现的传染病的方法提供了重要的信息。缺乏适应性免疫系统，虾
3、依靠自身有效的细胞和体液免疫反应来对抗入侵的微生物3。细胞免疫反应包括吞噬、结瘤和包囊作用，体液反应涉及多种免疫蛋白的合成和释放，如抗菌肽（AMPS）、蛋白酶抑制剂、细胞因子样因子等。在包括虾的甲壳类动物中，主要的免疫反应发生在血淋巴，血淋巴包含三种不同类型的血细胞，分别被定义为透明的、颗粒的、半颗粒状态血细胞4。一些免疫分子在被细菌或/和真菌细胞壁组分如肽聚糖（PG）、脂多糖（LPS）、葡聚糖（BGs）激活并被释放到血淋巴之前产生并储存于颗粒血细胞中。模式识别蛋白（PRPs）或者模式识别受体（PRRs）能识别并结合微生物的细胞壁成分，并激活各种免疫反应6-8。在这篇综述中，我们描述了虾中通过
4、基因组高通量技术和蛋白组分析发现免疫先关分子的过程，及这些参与大部分对抗病原体入侵的免疫反应的免疫相关分子的特性描述。2. 通过高通量基因组/蛋白组方法发现免疫基因/蛋白2.1 用表达序列标签(EST)分析对虾中的免疫基因虾有一个相对比较大的、大约2x109bp的基因组，在某种程度上反映着其存高比例的重复序列10。南美白对虾的基因组测序正在进行，但是相关信息还没有公开。到目前为止，虾基因组信息很大程度上通过表达序列标签（EST）分析获得。这就可以鉴定出可能与虾免疫反应有关的候选基因和一些组织特异性转录（表1）。尽管如此，对这些免疫基因和蛋白质的功能还是知之甚少，几乎所有的都需要进一步的研究，以
5、表明它们在虾免疫系统中的作用。对从各种细胞和组织中得到的表达序列标签（EST）库的分析提供了关于基因表达的组织特异性装配及相对转录丰度的信息，这些可能反应了那些细胞或者组织的功能。同样地，对比不同病原体感染的表达序列标签（EST）或者比较在感染后不同时间的控制组组织的表达序列标签（EST），可以知道基因转录表达水平随时间的推移明显改变，这是感染的结果。在昆虫中无脊椎动物的免疫系统已经研究的很好了，包括著名的模式生物黑腹果蝇，其大量的存储表达序列标签（EST）序列（821,005 ESTs as of May, 2012）在公共数据库中可见，这是基于大量的基因特性研究的。此外，现在一些其他昆虫的
6、免疫相关基因已被鉴定和描述。相反，甲壳类动物包括虾的相关信息要少得多。对于对虾来说，只有216,436个表达序列标签（ESTs）（占ESTs总数量的0.3%）储存在GenBank中，是由161,241个从南美白对虾得到的ESTs、39,397个从斑节对虾中得到的ESTs、10,446个从中国对虾得到的ESTs以及5352个从其他对虾得到的ESTs组成的。为了获得更多的关于虾基因组的信息，根据不同的目的，从正常条件下、胁迫条件下或者有病原体存在条件下饲养的虾的多种组织中已经构建了数个表达序列标签（ESTs）11-13。2011年，Leu等人14根据南美白对虾、斑节对虾、中国对虾和日本对虾四种主要
7、的对虾的表达序列标签（ESTs）库建立了一个虾转录组数据库。为了分离虾免疫相关基因，在南美白对虾、斑节对虾、中国对虾三个虾种建立了大规模的EST库11-13。OLeary等人12依据南美白对虾的多种组织建立了cDNA文库，这些cDNA文库用尽了剩余的转录体。在总的13,656个EST克隆中，7896个EST克隆是从六种非均一化的cDNA文库中随机测序的，这六种非均一化的cDNA文库分别来源于血细胞、肝胰腺、鳃、淋巴器官、眼柄和腹神经索。另外5760个EST克隆是从34种不同的抑制消减杂交（SSH）得到的cDNA文库中随机选择的，cDNA文库分别来源于血细胞、肝胰腺、鳃、淋巴器官、眼柄和腹神经索
8、，这些可能是免疫相关器官15。分析这些序列发现，7466个单拷贝序列由1981邻接片段/重叠群和5485个单独片段表示/组成，38%的这些单拷贝序列与GenBank数据库中存储的基因是同源物。近40%的EST克隆来源于血细胞，血细胞可能是虾基本的/重要的免疫细胞。通过以上分析，确定了一些潜在的免疫基因，包括AMPS、蛋白酶抑制剂、凝固蛋白、热激蛋白（HSPs）。Tassanakajon等人11报道了对15个从斑节对虾得到的cDNA文库的表达序列标签的分析，包括13个标准cDNA文库，2个正常cDNA文库。对于标准库来说，用从健康虾和微生物胁迫的或者热应激的虾的六种不同组织（血细胞、肝胰腺、淋巴
9、器官、眼柄、造血组织和卵巢）来指出潜在的与免疫防御、生长和性别分化有关的候选基因。此外，这2个正常cDNA文库是基于肝胰腺和淋巴器官产生的。得到了总数为10100的EST克隆，聚成917个重叠群/邻接片段和3928个单独片段，代表4845个单拷贝序列（在http:/ pmonodon.biotec.or.th可见）。这些序列与GenBank中现有序列有49%的同源性。假定在所有的血细胞库中免疫基因是主要的（10-13%），但是在正常情况下和由不同病原体感染或者热激处理情况下，表达模式不同。Leu等人16报道了对斑节对虾虾苗正常组和白斑综合症病毒感染组的cDNA文库的EST分析。对正常组文库中6
10、964个EST克隆和病毒感染组文库7686个EST克隆进行测序，重组为9622个单拷贝序列包括1364个重叠群/邻接片段和8258个单独片段。在同源性检索后，正常组cDNA文库中45%（3022）的ESTs（表达序列标签）与GenBank数据库中储存的基因相匹配，43%（2870）与UniProt数据库中的蛋白序列相匹配。在病毒感染组cDNA文库中，有46%（3338ESTs）和44%（3202ESTs）分别与GenBank数据库和UniProt数据库中的基因相匹配。在中国对虾中，大量的表达序列标签是从头胸部cDNA文库中得到的12。随机测序10446个表达序列标签，在重组之后包含1399个重
11、叠群/邻接片段和1721个单独片段，形成3120个单拷贝序列。在这些单拷贝序列中，13733个（44%）与GenBank中的序列相匹配，有81个可能是免疫相关基因。基于表达序列标签序列信息，已经构建了含有单拷贝序列的虾DNA基因芯片，用它来研究病原体感染后15,17-23、用抗生素或者PG处理后24,25、环境胁迫时26基因表达。此外，在斑节对虾中用基因芯片对成熟卵巢中响应眼柄切除的基因表达作了分析27。Aoki等人17最近评述了基于基因芯片的分析虾免疫反应的方法。对感染白斑综合症病毒的虾的免疫基因进行分析，结果表明在白斑综合症病毒感染后中国对虾头胸部中基因的表达上调了。为了研究白斑综合症病毒
12、感染后血细胞的基因表达水平21，建立了斑节对虾的cDNA基因芯片，同时，也研究了WSSV存在下肝胰腺、血细胞、肌肉和腮的转录情况15。基因芯片分析表明组织类型的不同和感染病原体的不同决定着基因表达模式的不同。Wang等人19比较了感染白斑综合增病毒和感染了热灭活的鳗弧菌的中国对虾的基因表达模式，同时Pongsomboon等人22分析了病毒（WSSV和YHV）和细菌（Vibrio harveyi）感染的虾基因转录表达。感染了WSSV或者YHV后的斑节对虾的基因总差异表达量比感染了哈维氏弧菌的斑节对虾分别提高了4.7倍和2.07倍，感染了WSSV的中国对虾的总差异表达量比感染了热灭活鳗弧菌的中国对
13、虾高2.5倍19,22。这表明病毒性感染可能比细菌感染更能影响宿主基因的转录水平。此外，感染WSSV虾的差异表达基因的数量比感染YHV虾的要多。包括抗脂多糖因子（ALF）和溶菌酶在内的许多免疫分子在哈维氏弧菌感染6h后明显上调28，同时，在细菌感染时，一些差异表达基因在感染初期的表达量最高。这也说明了先天免疫系统对病原入侵在改变基因表达水平方面的快速反应，在感染的第一个小时至数天里可以观察到这个影响3。相反地，一些差异表达基因的数量，包括铁蛋白、纤胶凝蛋白、PmAV、蛋白酶抑制剂、羧酸酯酶-6、精氨酸酶、转录的或翻译的蛋白、核糖体蛋白，在病毒感染后期达到最高（感染后48h）。这些基因的上调表明
14、在感染后期它们可能参与虾抗病毒反应或者修复由病毒或者免疫反应引起的细胞损伤或死亡的组织。此外，虾在濒死阶段可能会表达由病毒诱导或者劫持的基因，以便使用宿主细胞的机制来复制和产生新的病毒颗粒。有趣的是，在病原诱导情况下，已经发现了一些未知的基因表达水平高度改变。显然，这些未知基因产物的功能需要进一步研究。虽然表达序列标签和基因芯片的分析能力是有限的，例如，有一些在转录表达水平改变不明显，但是参与翻译后修饰或者信号级联反应的早期阶段的、低表达量的重要免疫调节因子，这些方法涵盖了大部分的现有的虾免疫力的知识，但是全基因组分析仍然无法使用。然而，为了完善这些方法，也使用了蛋白质组学方法，但是都受限于缺
15、少良好的转化载体和永久细胞系，与昆虫相反，随后的研究受限于瞬时基因的敲除和酵母双杂交系统的应用（见下一节）。2.2 免疫蛋白的蛋白质组学分析虾的免疫应答的研究不仅仅受限于缺少基因数据，也受限于对翻译后控制没有一个很清楚的了解。虾蛋白重要性和生物学功能的识别、鉴定和作用的研究主要是对基于基因和同源性的技术的探讨。然而，对于发现新的蛋白和鉴定虾蛋白实际功能来说，基于蛋白质组学的方法更重要。上面部分是描述基因组学方法的用途是识别和鉴定，下面描述一下最近被应用于虾蛋白研究的蛋白质组学技术。双向电泳（2DGE）或双向液相色谱-质朴分析法等蛋白质组学技术，已被应用于虾蛋白质组的研究和监测在环境胁迫和各种病
16、原微生物感染情况下蛋白质合成的改变。蛋白质组学中的鸟枪法鉴定了11个新的病毒蛋白，从斑节对虾感染了WSSV的上皮细胞中坚定了429个宿主蛋白29。用双向电泳分析健康中国对虾的淋巴器官蛋白质组，其可被分为13大类，大部分是细胞骨架蛋白30。研究了在环境胁迫下蛋白质表达的变化，如在低氧应激和高密度育苗养殖池条件下31,32。Silvestre等人32认为，在养殖斑节对虾时，潜在的丰富的血蓝蛋白和血淋巴肉瘤质钙结合蛋白可以被用作环境胁迫水平的生物标记物32。然而，确认和量化这种可能性需要进一步的研究。然而，主要的兴趣一直集中在宿主-病原体的相互作用，其中，有关对感染病原体的虾的翻译水平的响应的知识对更深层次理解虾免疫方面和基因组学方法有帮助。比较蛋白组学分析已经被应用于鉴定病毒和细菌感染后的表达差异水平。例如，从感染WSSB的虾的上皮细胞、鳃、肝、胃组织中分离鉴定出差异表达蛋白。此外，WSSV感
