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1、分子生物学 第六章,李伟 2011-10,基 因 治 疗 Gene therapy,狭义概念 将具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。,第一节 基因治疗的概念及其策略 一、基因治疗（ Gene therapy ）概念,广义概念 将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。,1. 分子缺陷清楚 2. 可以得到相应基因的克隆 3. 病理生理机制已知 4. 有利的风险-利益比 5. 治疗基因可以被调控 6. 合适的靶细胞 7. 有效安全 8. 相关法规健全,基因治疗的必备条件：,（1）基因矫正（gene correction） 对于
2、致病基因中的异常碱基进行精确修复，使其恢复正常功能； （2）基因置换（gene replacement） 用正常基因在原位替换致病基因，使细胞DNA完全恢复正常状态； （3）基因增补（gene augmentation） 将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到染色体中一起表达，以补偿缺陷基因的功能 ，但致病基因未去除； （4）基因表达调节（modulation ） 指将特定的反义核酸、RNA干扰或核酶等技术抑制目的基因表达从而消除致病基因的作用。,第一节 基因治疗的概念及其策略 二、基因治疗的总体策略,针对致病基因而言,第一节 基因治疗的概念及其策略 二、基因治疗的总体策略,（1）自杀基因 这
3、种基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将原无细胞毒性或低毒药 物前体转化为细胞毒物质，将细胞受体细胞杀死，这种基因被称为“自杀基因”。自杀基因导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞杀死。但对正常细胞则无伤害作用。 （2）免疫基因治疗 将某些细胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因导入肿瘤患者体内，以增强患者的抵抗力。 （3）耐药基因治疗 在肿瘤化疗过程中， 把产生抗药物毒性的基因导入患者体内，从而使患者能耐受更大剂量的化疗。 （4）More,针对非致病基因而言,第一节 基因治疗的概念及其策略 二、基因治疗的总体策略,Germ line gene therapy In the case of germ l
4、ine gene therapy, Germ cells, i.e., sperm or eggs, are modified by the introduction of functional genes, which are integrated into their genomes. Therefore, the change due to therapy would be heritable and would be passed on to later generations. This new approach, theoretically, should be highly ef
5、fective in counteracting genetic disorders and hereditary diseases. However, many jurisdictions prohibit this for application in human beings, at least for the present, for a variety of technical and ethical reasons. Somatic gene therapy In the case of somatic gene therapy, the therapeutic genes are
6、 transferred into the somatic cells of a patient. Any modifications and effects will be restricted to the individual patient only, and will not be inherited by the patients offspring or later generations.,第二节 基因治疗的基本程序,第二节 基因治疗的基本程序,第二节 基因治疗的基本程序,1. 目的基因的选择和获取 2. 目的基因与转运载体结合 3. 靶细胞的确认 4. 载体携带外源基因进入细
7、胞 5. 外源基因的整合 6. 外源基因的表达及检测 7. 治疗作用及稳定性、安全性评价,第二节 基因治疗的基本程序,在了解疾病发生的分子机制基础上，选择对疾病有治疗作用的 特定基因。如对单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基 因即可用于治疗； 对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因或抑癌 基因用于基因治疗。 治疗性基因获得的方法很多： 用酶切或探针杂交法从基因组DNA文库获得，从cDNA文库获取， PCR扩增，人工合成等。,第二节 基因治疗的基本程序 一、目的基因,基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。 常用的载体有两类：病毒载体和非病毒载体。
8、 病毒载体：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒载体、疱疹病毒载体等 非病毒载体：裸露DNA、脂质体、分子耦联载体、染色 体载体、多聚物、纳米载体等。 ： 与病毒载体的主要区别在于：采用理化方法将治疗基因转移入患者体内。,第二节 基因治疗的基本程序 二、转运载体,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运,Safety: deletion of a part of the viral genome critical for viral replication. Such a virus can efficiently infect cells but, once the infection
9、has taken place, requires a helper virus to provide the missing proteins for production of new virions. Low toxicity: The viral vector should have a minimal effect on the physiology of the cell it infects. Stability: Some viruses are genetically unstable and can rapidly rearrange their genomes. Cell
10、 type specificity: Most viral vectors are engineered to infect as wide a range of cell types as possible. Identification: Viral vectors are often given certain genes that help identify which cells took up the viral genes. These genes are called Markers, a common marker is antibiotic resistance to a
11、certain antibiotic.,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运（逆转录病毒载体）,逆转录病毒载体 1、逆转录病毒载体的结构,逆转录病毒载体的特点 （1）结构和感染过程与普通逆转录病毒相似； （2）可使靶细胞变成稳定表达目的基因的转化细胞； （3）感染靶细胞后不扩散； （4）假病毒感染靶细胞的效率非常高； （5）不感染非增殖细胞。,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运（逆转录病毒载体）,同时也存在一定的缺点: 容量小，只能容纳8kb-10kb的外源基因片段； 血清补体能使之失活； 病毒滴度低，低于治疗大肿瘤需要的滴度； 病毒整合到DNA后，可能引起插入突变和激活癌基因的
12、可能； 宿主范围有限，只感染增殖细胞，故在应用 上有一定局限性。,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运（逆转录病毒载体）,慢病毒(HIV)载体 Lentivirus,优点：高效感染宿主细胞，并且其感染范围广；能逃避人体 免疫系统的监视，从而防止免疫排斥,缺点：引起抑癌基因的受抑和原癌基因的激活，以及对细胞 的毒性和产生变种病毒,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运,腺病毒载体 1、结构,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运,2、腺病毒载体特点 （1）宿主范围广 （2）腺病毒蛋白表达不以宿主增殖为必要条件 （3）可获得高病毒效价 （4）重组体非常稳定 （5）不会引起肿瘤 （6）
13、有较高的安全性 （7）无包膜，不易被补体灭活，可直接在体内应用 （8）不整合入染色体,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运（腺病毒载体）,腺病毒表达系统与慢病毒表达系统的比较,单纯疱疹病毒载体,2、特点 （1）滴度高 （2）容量大 （3）增殖细胞和非增殖细胞均可感染 （4）不整合，但可长期存在并可稳定表达,1、结构,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运,痘苗病毒载体,线形双链DNA的有包膜病毒 ，其核心颗粒不依赖 宿主细胞而独立引进转录和复制，宿主范围广泛 且易于培养，容易获得高滴度的病毒颗粒。同时 痘苗病毒基因组中大量非必需基因的缺乏并不影 响其在宿主细胞的复制能力，可允许在同一
14、或不 同非必需区插入多个基因，以表达多种或一种外源蛋白。,缺点：细胞毒性；病毒能被人体的补体系 统灭活并降解,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运,脂质体,脂质体载体是用人造双层磷脂质，包装DNA 后形成的脂质体-DNA复合物。脂质体载体无毒无抗原性，目的基因与脂质体的包裹使其可以免受核酸酶降解，容量大，可单独或联合其他载体使用，并可通过静脉注射使目的基因进入特定部位。 缺点：表达时间短，不能通过细胞膜屏障,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运,分子耦联载体,分子耦联载体由DNA、DNA结合因子和配体三部分组成。配体与特异的受体结合，经受体介导的细胞内吞途径，将目的基因转移至细胞内
15、。,缺点：DNA易被降解，降低了基因转移效率； 靶向性不高,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运,多聚物载体是利用带正电荷的多聚阳离子与带负电荷的DNA相结合，形成稳定的多聚复合物，使DNA不易被核酸酶降解，并可与细胞表面带负电荷的受体相结合，而被摄入到细胞中。,多聚物载体,聚合物聚乙烯亚氨(PEI) ：PEI分子量的增加，其对细胞的转染效率和细胞毒性同时增加； 聚乙二醇(PEG) ：降低PEI的毒性 ； 聚D，L22，42二氨基丁酸(PDBA) ：一种新型多聚物基因载体,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运,裸露质粒DNA,将裸露质粒DNA直接注入肌肉，外源基因在肌肉中的表达量与
16、注入的外源基因含量成正比，与溶液体积无关。,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运,染色体载体,一些参与哺乳动物基因表达和复制的染色体成分如转座子、基因隔离子、增强子、基因座控制区、核骨架结合区以及基质结合区等在转基因实验中，均被用来设计载体，并整合入基因组而发挥作用。转座子是一类小的DNA片段，可以在染色体不同的区域移动并携带遗传信息；转座子的整合位点具有可预测性，从而提高转基因治疗的安全性。,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运,细胞转导肽介导基因导入系统,蛋白质之所以能够进入细胞，就是因为在它们的结构中含有能够携带生物大分子进入细胞的多肽-细胞转导肽。如果将这个多肽结构和目的基因结合，它就能将目的基因带入靶细胞。细胞转导肽的表达效率高，但价格昂贵，稳定性差，在一定程度上限制了它的应用。,第二节 基因治疗的基本程序 二、基因的转运（其他新型载体 ）,2. 纳米微生物技术基因治疗载体,纳米微生物具有许多优点： 1)纳米脂质体主要由磷脂以及胆固醇合成，可以通过与细胞膜 的融合或者胞吞作用将目的基因导入靶细胞； 2)纳米微生物材料具
