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1、第十四章 全自动DNA测序仪和 蛋白质自动测序仪,元素周期表的发现奠定了二十世纪物理、化学研究和发展的基础,元素周期表,“基因组序列图”将奠定二十一世纪生命科学研究和生物产业发展的基础！,“基因组”-生命科学的“元素周期表”,人体解剖图奠定了现,代医学发展的基础,生命的奥秘蕴藏于 “四字天书”之中,GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCA TCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCT CCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTC GCTTTCTTGCCGCCACCATG
2、CCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCT,了解生命现象、解释疾病的发生、诊断和治疗疾病，是生命科学的核心内容之一 核酸和蛋白质是控制生命过程的两种重要大分子，其结构或功能异常是导致遗传性疾病或遗传相关性疾病的主要因素或相关因素，是生命科学研究的主要对象,核酸分子携带生命活动的全套信息，其基本结构核苷酸的线性排列构成它的一级结构 蛋白质的一级结构是指构成蛋白质的基本单位氨基酸的排列顺序，研究蛋白质的一级结构是了解蛋白质功能的基础,第一节 全自动DNA测序仪,DNA测序 核苷酸序列 早期：小片段重叠法 通过测定RNA序列来推测DNA序列 缺点：既费时又不准确 20世纪80年代以后 ：DNA自
3、动测序仪 Sanger双脱氧链末端终止法 Maxam-Gilber化学降解法 优点：操作简单、安全、快速、准确,Sanger双脱氧链末端终止法 Maxam-Gilber化学降解法 都是根据在某一固定的点开始核苷酸链的延伸，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A、T、C、G四组不同长度的一系列核苷酸链，在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行片段的分离和检测，从而获得DNA序列 双脱氧链末端终止法更简便和更适合于光学自动探测，故在全自动DNA测序仪中应用广泛,原理 一个末端标记的DNA片段在4组互相独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异的针对某一种或某一类碱基。因此生成4种放射性标记的分子，从
4、共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。,Maxam-Gilber化学降解法,基本步骤 第一步，对特定碱基（或特定类型的碱基）进行化学修饰； 第二步，修饰碱基从糖环上脱落，修饰碱基5和3的磷酸二酯键断裂； 第三步，比较G、A+G、C+T、C以及AC各个泳道，可从测序凝胶的放射自显影片上读取DNA序列。,特点,重现性好，所用试剂简单，易于掌握； 所测长度比Sanger法短一些，对放射性标记末端250个核苷酸以
5、内的DNA序列效果较好； 序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所生成的拷贝； 可对合成的寡核苷酸进行测序，用以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA的二级结构及蛋白质-DNA相互作用。 无需延伸反应及克隆 更适于含有稀有碱基或GC含量高及短链寡核苷酸的测序，可双向标记并测序。 比较繁琐费时，过长序列有困难。,12,13,14,（一）双脱氧链末端终止法测序原理,利用DNA的体外合成过程聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR） DNA聚合酶的催化 以目的DNA为模板 按照碱基互补配对原则 在引物的引导下,单核苷酸聚合形成新DN
6、A链,普通的PCR反应体系中，加入的核苷酸单体为 4种2-脱氧核苷三磷酸（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）,dNTP结构示意图,测序反应体系中，加入的核苷酸单体为 2,3-双脱氧核苷三磷酸 （ddNTP）,ddNTP结构示意图,PCR（聚合酶链式反应）原理,反应所需物质：DNA模板、引物、DNA聚合 酶、dNTP、缓冲液 每个循环包括：变性（90）、退火（54 ）、延伸（72 ）,与dNTP相比，ddNTP在脱氧核糖的位置上缺少一个羟基，反应过程中虽然可以在DNA聚合酶作用下，通过其磷酸基团与正在延伸的DNA链的末端脱氧核糖-OH发生反应，形成磷酸二酯键而掺入到DNA链中，但它们本身没
7、有-OH，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，从而使正在延伸的DNA链在此终止。,据此原理分别设计四个反应体系，每一反应体系中存在相同的DNA模板、引物、四种dNTP和一种ddNTP(如ddATP)，则新合成的DNA链在可能掺入正常dNTP的位置都有可能掺入ddNTP而导致新合成链在不同的位置终止。 由于存在ddNTP与dNTP的竞争，生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段。,dNTPs,双脱氧链末端终止法测序反应原理（1）,双脱氧链末端终止法测序反应原理（2）,双脱氧链末端终止法测序反应原理（3）,双脱氧链末端终止法测序反应原理（4）,双脱氧链末端终止法测序反应原理（5）,（二）新生链
8、的荧光标记原理,早期采用同位素法标记新生链，因其具有放射性危害、背景高等缺点而很快被荧光染料标记法所取代 荧光染料的荧光和散射背景较弱，提高了信噪比；它们的激发光谱较接近而发射光谱均位于可见光范围，且不同染料的发射光谱相互分开，易于监测，故在DNA自动测序中得到广泛应用,荧光染料 标记法,单色荧光标记法 多色荧光标记法,荧光标记引物法 荧光标记终止底物法,荧光标记引物法 荧光标记终止底物法,多色荧光标记法 - 荧光标记引物法 定义：将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的5端 一组（4种）荧光标记引物，其序列相同，但标记的荧光染料颜色不同 测序反应中，模板、反应底物、DNA聚合酶及标记引物等按A
9、、T、C、G编号被置于4支微量离心管中，A、T、C、G四个测序反应分管进行，上样时合并在一个泳道内电泳。特定颜色荧光标记的引物则与特定的双脱氧核苷酸底物保持对应关系,荧光标记引物法,图18-8 荧光标记引物法原理,多色荧光标记法 - 荧光标记终止底物法 定义：将荧光染料标记在作为终止底物的双脱氧单核苷酸上 反应中将4种ddNTP分别用4种不同的荧光染料标记，带有荧光基团的ddNTP在掺入DNA片段导致链延伸终止的同时，也使该片段端标上了一种特定的荧光染料 经电泳后将各个荧光谱带分开，根据荧光颜色的不同来判断所代表的不同碱基信息,模板：T C C A T G A T 产物：A A G A G G
10、 A G G T A G G T A A G G T A C A G G T A C T,新生链的荧光标记原理,都确定了4种荧光染料与4种ddNTP所终止的DNA片段之间的专一对应关系 荧光标记引物法使荧光有色基团标记在长短不同的DNA片段的端，可理解为荧光染料标记过程和延伸反应终止分别发生在同一DNA片段的两端，且标记发生在引物与模板的退火过程中，而终止是发生在片段延伸过程中，两者在时间上有一定间隔 荧光标记终止底物法使标记和终止过程合二为一，两者在同一时间完成 在具体操作中，前者要求A、C、G、T四个反应分别进行，而后者的四种反应可以在同一管中完成,荧光标记引物法和荧光标记终止底物法的异同
11、点：,单色荧光标记法 也包括荧光标记引物法和荧光标记终止底物法 与多色荧光标记法不同的是单色荧光标记引物法和荧光标记终止底物法均需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增管中进行，电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳,均可分为荧光标记引物法和荧光标记终止底物法 单色荧光标记法需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增管中进行，电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳 多色荧光标记引物法需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增管中进行，电泳时可合并在同一泳道中电泳 多色荧光标记终止底物法可将A、C、G、T四个反应在同一扩增管中进行，电泳时在同一泳道中电泳,单色荧光标记法与多色荧光标记法的异同点：,（三）
12、荧光标记DNA的检测原理,测序反应一般以单引物进行DNA聚合酶延伸反应，绝大多数产物均为单链 反应结束后，样品经简单纯化处理就可以放置到自动测序仪中开始电泳 两极间极高的电势差推动着各个荧光DNA片段在凝胶高分子聚合物中从负极向正级泳动并达到相互分离，且依次通过检测窗口 由激光器发出的极细光束，通过精密的光学系统被导向检测区，在这里激光束以与凝胶垂直的角度激发荧光DNA片段,DNA片段上的荧光发色基团吸收了激光束提供的能量而发射出特征波长的荧光 代表不同碱基信息的不同颜色荧光经过光栅分光后再投射到CCD摄像机上同步成像。收集的荧光信号再传输给计算机加以处理 整个电泳过程结束时在检测区某一点上采
13、集的所有荧光信号就转化为一个以时间为横轴坐标，荧光波长种类和强度为纵轴的信号数据的集合 经测序分析软件对这些原始数据进行分析，最后的测序结果以一种清晰直观的图形显示出来,多色荧光标记技术检测优点： 一个样本的四个测序反应产物可以同时在一个泳道内电泳，避免单一标记时四个泳道测序因泳道间迁移率不同对精确度的影响，提高了测序精度 一个样品所有反应产物只需进样一次，所以一次实验便可以处理较之手工方法更多的样品。在相同样品数的情况下，加样的工作量也大大减少,DNA序列测定的策略,克隆亚克隆的方法 (clone-by-clone) 全基因组散弹法(鸟枪法) (whole-genome shotgun me
14、thod),两种大规模基因组测序策略的比较,克隆亚克隆的方法 (clone-by-clone),是以物理图谱为基础、以大插入片断克隆为单位的定向测序策略。其方法是先构建议染色体为单位的遗传图谱，再利用高覆盖率的大片断基因组文库（BAC、YAC等）获得精细的物理图谱，选择合适的BAC或YAC克隆进行亚克隆测序，用计算机拼装，通过引物步移等手段填补BAC内的空洞，形成一条完整的BAC序列。然后参照物理图谱，将相互关联、部分重叠的BAC克隆联成一个大的重叠群(Contig)。但一些长串联的高度重复序列区域和克隆或测序所不能获得的区域，仍会存在一些物理空洞（Physical Gap）。与Shot-gu
15、n方法相比较，Clone by Clone的技术难度较高，尤其是大片段基因组文库（如BAC文库）的精细物理图谱的构建是技术性极强的工作；并且测序费用和所需的时间也相对较多。,人类基因组计划研究的主要成果和进展表现在这“四张图”,遗传图谱 又称为连锁图谱（linkage map），指基因或DNA标志在染色体上的相对位置与遗传距离 物理图谱 以定位的DNA标记序列如STS作为路标，以DNA实际长度即bp、kb、Mb为图距的基因组图谱。 转录图谱 利用EST（expressed sequence tags 表达序列标签）作为标记所构建的分子遗传图谱 序列图谱 通过基因组测序得到的，以A、T、G、C为
16、标记单位的基因组DNA序列,全基因组散弹法(鸟枪法) (whole-genome shotgun method),是借助物理和化学的手段，将整个基因随机打断成一定大小的片段进行测序，再根据序列间的重叠关系进行计算机拼接和组装，确定它们在基因组中的位置。Shot-gun的优点是速度快、简单易行、成本较低，可在短时间内通过集中设备和人力获得海量的基因组序列。缺点在于序列的拼接组装比较困难，在重复序列较多的区域难度更大；由于缺少基因组的物理图谱，有些序列难以准确定位，成为游离片段；此外，受文库的随机性和测序的覆盖度的影响，某些区域会形成较大的空洞（Gap）,二、全自动DNA测序仪的结构与功能,全自动DNA测序仪 平板型电泳的凝胶灌制在两块玻璃板中间，聚合后厚度一般小于0.4mm或更少，因此又称为超薄片层凝胶电泳 毛细管电泳技术将凝胶高分子聚合物灌制于毛细管中
