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1、一 教学要求,掌握酶联免疫吸附试验的基本方法及其原理 学习双抗夹心法检测抗原物质的基本操作,实验八 酶联免疫吸附试验（ELISA）,二 实验原理 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques) 上发展起来的一种新型免疫测定技术，ELISA过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体, 再加相应酶标记抗体，生成抗原-待测抗体-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。同理也可包被抗
2、体，测定抗原含量。 ELISA最常用的四种方法：直接法测定抗原；间接法测定抗体；双抗体夹心法测定抗原；竞争法测定抗原。,（1） 直接法测定抗原 A. 将抗原吸附在载体表面； B. 加酶标抗体，形成抗原抗体复合物； C. 加底物。底物的降解量抗原量。,（2）间接法测定抗体 A. 将抗原吸附于固相载体表面； B. 加抗体, 形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体； D. 加底物。 测定底物的降解量抗体量。,（3）双抗体夹心法测定抗原 A. 将抗体吸附于固相表面; B. 加抗原，形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体; E. 加底物。底物的降解量抗原量。,（4）竞争法测定抗原 A. 将抗体吸附在
3、固相载体表面; B. 加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。,三 材料与器材（略）,（1）抗体包被：羊抗人IgG 酶联板每孔加100 L，4 过夜；甩净。 （2）封闭：2% 小牛血清，每孔加100 L，37 封闭30 min；封闭后洗三次（前两次用自来水冲、甩； 第三次用洗液， 并静置 3 min，甩） （3）加待测抗原：正常人血清稀释成,1:5,1:10,1:20,1:40,1:80 ,生理盐水作为对照，每孔加 100 L，注意从高稀释度到低稀释度加样，37 孵育1h ；洗三次 （4）加酶标抗体：HRP-IgG（P
4、BS-Tween，5%BS；1：800稀释）， 每孔加 100 L，37 ，30 min；洗三次,四 操作 步骤,（5）酶催化反应：底物显色剂（0.2 mol/L Na2HPO4 加1:1的0.1M柠檬酸，3% H2O2 加1.5L/mL，TMB（DMSO溶，10 mg/mL）每孔加50 L，37 闭光反应15 min； （6）加2mol/L H2SO4 50 L 终止反应，观察颜色反应，并用酶标仪测量OD。,五 注意事项,（1）正确洗涤酶标板，加洗涤液时要小心，勿使洗涤液溢出，流入周围孔中，造成交叉污染。洗涤后应尽量甩干孔内残液。洗涤液加入孔后，须保持 3 min再弃去。 （2）加样品时应从最高稀释度逐一加至最低稀释度，这样可以不换吸头。 （3）底物应在临用前配制，同时注意避光。,六 思考题,（1）分析酶标抗体不纯对抗原检测结果的影响（双抗夹心法） （2）比较免疫荧光法和ELISA的最适检测对象。,
