基因克隆

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1、分子克隆,Molecular Cloning,分子克隆,基本概念: DNA重组技术是在分子水平对基因进行体外操作，因而也称为分子克隆(molecular cloning)或基因克隆。 基本概念: 分子克隆：是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程,基因克隆的含义,找到基因 获得基因一定数量的拷贝 分析基因的结构等特征 确定 基因表型(疾病) 的关系,“基因”：完整基因/等位基因型/基因片段； DNA基因/RNA基因/未知基因？,文库,cDNA文库 基因文库,cDN

2、A文库,cDNA文库(cDNA library)是指利用基因克隆的方法保存在宿主细胞中的DNA重组体的群体，每一重组子只含一种mRNA信息。 cDNA 文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。,cDNA文库的构建,cDNA 文库的构建 cDNA 文库的构建共分四步： 第一，细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离； 第二，第一链 cDNA 合成； 第三，第二链 cDNA 合成； 第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。,细胞总RNA的分离,mRNA分子3末端均含有一段polyA尾

3、巴 一段oligo(dT)能够同惰性物质如纤维素或琼脂糖结合。当细胞总RNA制剂通过已用oligo(dT)处理过的纤维素柱时，mRNA分子的poly A尾巴便会同oligo(dT)序列杂交而粘附到柱子上。 用不同离子浓度的缓冲液进行洗脱，即可分离得到mRNA。,1、人脑， 2、人脂肪，3、人胰腺，4 、 小鼠脑， 5 、小鼠卵巢，6 、大鼠肾，7 、大鼠胃,总RNA电泳图,合成第一链cDNA,由mRNA到cDNA 过程称为反转录，是由反转录酶（reverse transcriptase）催化的。 oligo(dT)引导的cDNA合成： 引物oligo(dT)引物与mRNA的3末端polyA配对

4、，引导反转录酶以mRNA为模板合成第一链cDNA 。 缺点：必须从3端开始，不利于较长mRNA的逆转录；由于cDNA末端存在较长的poly A而影响cDNA测序。,随机引物引导的cDNA合成： 采用 610 个随机碱基的寡核苷酸短片段作为合成第一链cDNA的引物。 cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生。 对于特长的mRNA分子中靠近5-端的序列，应用此方法较为容易得到克隆。,合成第二链cDNA,双链 cDNA 克隆进载体,先用末端转移酶给双链cDNA分子加尾，或者更常用的是将人工合成的衔接物加到双链cDNA分子的两端，而后再同经适当处理而具有相应末端的载体分子连接。 将如此构成的

5、重组体分子导入大肠杆菌寄主细胞进行扩增，于是便得到了所需的cDNA文库。,不同丰度mRNA 的cDNA克隆,选用cDNA克隆这一实验方案，必须考虑到目的基因的mRNA在特定的生物体组织中的含量问题。 在许多组织和培养的细胞中，各种mRNA的含量都是极不相同的。其中，有些类型的mRNA含量十分丰富，每个细胞可拥有数千个拷贝，而有些类型的mRNA的含量则相反，每个细胞只有少数几个拷贝。 根据mRNA分子含量的多少，可以将mRNA划分为高丰度、中丰度和低丰度三种不同的类型。,高丰度mRNA的cDNA克隆,胰脏组织中的胰岛素基因的mRNA，血红蛋白细胞中的珠蛋白基因的mRNA，等等都属于高丰度mRNA

6、。从这些组织或细胞分离出来的细胞质且mRNA制剂中，目的基因mRNA的比例可高达50%90%。 这类特殊的mRNA甚至不需要进一步纯化就可以直接用来合成双链的cDNA，并构建cDNA基因文库。 高丰度mRNA的cDNA克隆的检测，一般是用32P标记的探针，从转化的细菌群体中筛选出含有目的基因序列的重组体克隆。,稀少mRNA的cDNA克隆,低丰度的mRNA的cDNA克隆，通常是构建成cDNA基因文库。大多数细胞的低丰度mRNA，建立105个克隆就已足够了。 一些含量极低的稀少mRNA的cDNA克隆，是无法应用菌落原位杂交技术检测的。 使用体外标记的mRNA或cDNA作探针，可以检测出仅占总mRN

7、A0.05%-0.1%的低丰度mRNA的cDNA克隆。,稀少mRNA的cDNA克隆,应用按分子量大小分部分离的技术富集克隆的mRNA 使用化学合成的寡聚脱氧核苷酸纯化特定的mRNA 差别杂交法筛选特异mRNA的cDNA克隆,基因文库,基因文库（gene library）： 用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA的所有片断随机地连接到基因载体上,然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。,基因文库的构建,cDNA分子比较小，可以在质粒载体上

8、克隆。在早期，人们也曾试图使用质粒作载体构建真核生物基因组文库，但没有获得成功。 质粒载体容纳外源DNA插入的能力有限，而且小分子量的质粒载体复制频率要比大分子量的重组质粒载体高得多。后者在复制过程中会再次受到选择，发生插入序列的逐渐丢失。 通常使用噬菌体载体或柯斯质粒载体构建高等真核生物染色体基因组DNA的基因组文库。,基因组DNA克隆简图,基因克隆的策略,功能克隆（ functional cloning） - 根据特异蛋白质分离目的基因的策略 表型克隆（ phenotype cloning ） - 根据特异mRNA 分离目的基因的策略,功能克隆 氨基酸序列 核苷酸序列 PCR 特异蛋白质

9、目的基因 抗体 基因文库筛选 评价 优点 - 在单基因性状的基因分离方面仍为常用策略 缺点 - 特异蛋白质确定、鉴定及其纯化困难 - 难以分离微量表达基因 - 无法研究无蛋白质产物的基因 - 难以进行多基因控制性状的基因分离,应用核酸探针分离克隆目的基因,当把基因文库转移到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜之后，就可以同特异性的核酸探针进行菌落或噬菌斑杂交，以便筛选出具有目的基因的阳性克隆。 分离目的基因的一个关键因素是如何获得实用性的核酸探针。,核酸探针的来源,高丰度mRNA构成的cDNA文库，只要直接测量少量的重组体分子的核苷酸序列，即可作为探针进一步筛选基因组文库。 高度保守的蛋白质的核苷酸编码序列

10、可作为同源DNA探针，如组蛋白基因、肌动蛋自基因及神经生长因子(-nerve growth faetor，NGF)等,核苷酸探针的人工合成,根据得到的蛋白质序列信息合成探针存在两难： 保证探针特异性，至少需要17个核苷酸； 遗传密码的简并问题。 通常选择密码简并程度最低的段由6个氨基酸组成的蛋白质序列，作为合成核苷酸探针的依据。,用作合成寡核苷酸探针依据的多肽分子，其中Cys、Asp、 Glu各自都有两个密码子。 据此合成的寡核苷酸，实际上是由8种不同序列构成的寡核苷酸库。,表型克隆 特异 mRNA（不同表型） 目的基因 评价 优点 - 无需事先了解基因及其蛋白质的任何背景 资料，可直接分离（

11、新）目的基因 - 可进行多基因控制性状的基因分离， 同时 综合性地研究多性状相关基因 缺点 - 存在不同程度的假阳性等,差异筛选（两样本比较，不同为差异） 差别杂交 (differential hybridization, DH) 差异显示 (differential display,DD) 差减杂交（两样本杂交，剩余为差异） mRNA减法杂交 (mRNA subtractive hybridization, mRNA-SH) cDNA代表性差异分析 (cDNA representational difference analysis, cDNA-RDA) 抑制性差减杂交 (suppressi

12、on subtractive hybridization, SSH),应用差别杂交或差减杂交法分离克隆目的基因,差别杂交 (DH) - McLaughlin M and Walbot V. Genetics 1987; 117: 771 - 776 实验组mRNA 对照组mRNA 分别制备探针（mRNA或cDNA) 分别筛选含目的基因的cDNA文库 阳性菌落x光底片显色 比较x光底片和对照平板，挑出含目的基因的菌落 鉴定目的基因,评价 优点 - 简便、直观 缺点 - 敏感性不高，难以获得低丰度差异表达基因 - 膜杂交筛选工作量大，信号强度可比性不佳,差异显示 (DD) - Liang P an

13、d Pardee AB. Science 1992; 257:967-971 实验组mRNA 对照组mRNA 分别RT- PCR扩增mRNA中特定片段 凝胶电泳分离 比较电泳图谱，寻找特异片段 鉴定目的基因,评价 优点 -简便、直观，可同时比较多组样本 缺点 -特异性不高,重复性差,比较基因组杂交,比较基因组杂交(comparative genome hybridization,CGH) 法是一种将消减杂交、荧光染色体原位杂交(fluorescence in situ hybridization FISH)相结合，用于检测待测组织DNA序列拷贝数目的变化(缺失、扩增、复制)，并将这些异常在染色

14、体上定位的方法。,将不同基因组DNA分别用不同颜色(绿、红) 的荧光标记后，等比例一同与染色体杂交，扫描不同染色体上两种颜色的比率变化，来判断该处存在缺失或扩增。,amba.charite.de,www.aist.go.jp,www.implen.de,评价,CGH法是消减杂交策略各方法中唯一不能直接获得基因片段的方法 其优点是一次实验即可对整个基因组进行检测，节省了操作步骤，并能将检测出的异常DNA序列在染色体上定位，便于进一步筛选相关基因。 其缺点是不能显示染色体易位、倒位及其他不改变DNA拷贝数目的异常。,基因芯片 (DNA芯片, 微阵列, microarray) 近年发展起来的分析基因

15、表达图式的新方法。将大量DNA片段探针分子固定于支持物上, 与标记的样品分子杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度获取样品分子数量和序列信息。其可高效快速地同时测定大通量基因的时空表达信息，已迅速应用于生命科学领域,基因芯片技术与传统杂交检测的比较,基因芯片技术从本质上说与PCR、Southern Blotting或Northern Blotting相同（所以Affymetrix曾与Southern就专利问题产生冲突），只是探针密度极高而已。不过，为此花费了大量的人力物力从事研制工作。当然，其结果也很是诱人。,酵母全基因组 12000 genes on 5 X 7 cm,基因芯片主要特点 操作简单, 自动化程度高 序列数量大, 检测效率高 应用范围广，成本相对低 检测敏感性高，后继工作有一定难度,基因芯片的基本构造,1.支持物：如玻片、硅片、NC膜、Nylon膜 2.探针：高密度的探针序列按照一定的次序固定在支持物上，每个位点的序列是已知的,外观,探针,支持物,剖面图,平面局部放大,基因芯片相关技术,硬件： 序列合成设备包括：核酸或多肽合成仪（作预合成点样用）、照相平板印刷及半导体制作相应设备（作光引导原位合成）。 激光共聚焦显微扫描