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1、第十章 甾体激素类 药物的分析,Analysis of Steroid Hormones,药物分析教研室,甾体激素,肾上腺皮质激素,性激素,雄性激素及蛋白同化激素,孕激素,雌激素,Contents,第一节 基本结构与性质,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,环戊烷并多氢菲母核,1.4-3-酮，C20酮基,2.C11： 或,4.A环上的酚羟基,5.卤素(-F)，酯基,以下主要基团可供分析：,第一节 基本结构与性质,一、肾上腺皮质激素,3,11,17,20,21,氢化可的松 (hydrocortisone),醋酸地塞米松 (d
2、examethasone acetate),16-甲基,21-酯化,17-羟基,9-氟,3-酮,1,2-双键,11-羟基,20-酮,二、雄性激素及蛋白同化激素,第一节 基本结构与性质,甲睾酮 (methyltestosterone),丙酸睾酮 (testosterone propionate),苯丙酸诺龙 (nandrolone phenylpropionate),17-羟基,第一节 基本结构与性质,三、孕激素,黄体酮 (progesterone),醋酸甲地孕酮 (megestrol acetate ),米非司酮 (mifepristone),第一节 基本结构与性质,四、雌性激素,雌二醇 (e
3、stradiol),(炔雌醇),炔诺酮 (norethisterone),第一节 基本结构与性质,第二节 Identification,物理常数的测定 化学鉴别法 制备衍生物测定熔点 UV IR TLC HPLC,第二节 Identification,一、物理常数的测定,1.熔点,第二节 Identification,第二节 Identification,二、化学鉴别法,2.比旋度 3.吸收系数,1.与强酸的呈色反应,第二节 Identification,2.官能团的反应, C17-醇酮基还原性,第二节 Identification, C3酮基和C20酮基, 甲酮基或活泼亚甲基,第二节 Ide
4、ntification, 卤素 酚羟基, 乙炔基,第二节 Identification, 酯基,黄体酮,三、UV 四、IR,第二节 Identification,酚羟基,醇羟基,炔键,羰基,苯环骨架振动,第二节 Identification,五、TLC,制剂分析 对照品法,炔诺酮,六、HPLC,第三节 Purity Test,一、TLC,地塞米松磷酸钠中杂质检查,第三节 Purity Test,氢化可的松中其他甾体检查,CHCl3-MeOH(9:1) 溶剂 硅胶GF254 二氯甲烷-乙醚-甲醇-水 385 :60 : 15 : 2 展开后晾干 105干燥10min 碱性四氮唑蓝显色,二、HPL
5、C,第三节 Purity Test,黄体酮中有关物质检查,供试品溶液的杂质峰数不得超过1个，其面积不得大于对照液的主峰面积的3/4,第三节 Purity Test,三、硒的检查,来源 合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢,四、溶剂残留,甲醇和丙酮(GC),0.3%,0.5%,第三节 Purity Test,五、游离磷酸盐检查,740nm，UV,第四节 Assay,HPLC UV 比色法,非水溶液滴定法,第四节 Assay,一、HPLC,己烯雌酚,黄体酮,第四节 Assay,二、UV,醋酸地塞米松,第四节 Assay,三、比色法,2,3,5-Triphenyltatrazolium chloride
6、 TTC (Red tatrazoline RT),甲潜(Formazan),深红色 max 480490nm,氢化可的松软膏的含量测定,第四节 Assay,精密量取对照品溶液及供试品溶液各1ml，分别置干燥具塞试管中，各精密加无水乙醇9ml与氯化三苯四氮唑试液1ml，摇匀，各再精密加氢氧化四甲基铵试液1ml，摇匀，在25的暗处放置40min45min，在485nm的波长处分别测定吸收度，计算，即得,第四节 Assay,（1）基团对反应速度的影响,（2） 溶剂、水分的影响, 无水乙醇(无醛),第四节 Assay,（3） O2与光线的影响,（4）碱的种类及加入顺序,反应应在强碱性（pH13.75
7、）条件下进行 以氢氧化四甲基铵的结果最佳,（5） 温度与时间,t甲瓒分解%,(二)异烟肼法(Isonicotinic acid hydrazide),第四节 Assay,第四节 Assay,影响因素,专属性强,无水,第四节 Assay,(4)酸、异烟肼的量,盐酸 : 异烟肼 = 2 : 1,样品 : 异烟肼 = 1 : 8 ,第四节 Assay,(三) Kober反应比色法,第四节 Assay,采用本法测定炔雌醇片及复方炔诺酮片、复方炔诺孕酮滴丸、复方左炔诺孕酮片中的炔雌醇的含量,第四节 Assay,四、非水滴定米非司酮,五、生物样品中的甾体激素的分析,刺激剂 麻醉剂 -阻断剂 利尿剂 遮蔽剂
8、 合成类固醇及2激动剂 肽类激素,内源性,兴奋剂检测特点,色谱方法是理想的检测手段。1976年使用气相色谱-质谱联用手段检测甾体，1980年开始用毛细管气相色谱法检测，至1984年大体基本定型。,药物及其代谢物的种类多，变化大，禁用的百余种药物以原体或一个或多个代谢产物的形式存在与人体体液中，因此，需要检测和确证的化合物多达几百种。除此以外，用药后的不同时间，这些化合物的浓度不断的发生变化，直到排出体外。 药物在人体体液中的浓度很低，药物在人体体液中的浓度常常是ng级或更低的水平，因此对检测的灵敏度要求很高。 要求准确的定性和定量，不能有丝毫的疏漏和差错。检测者要对每一种药的药物代谢动力学及光
9、谱分析有全面娴熟的了解及足够的分析参考资料,检测基质,1.尿液,尿样检测是兴奋剂检测的理想样本。其优点在于：取样方便；对人无损害；尿液中的药物浓度高于血液中的药物浓度；尿液中的其他干扰少。,2.血样,补充尿样分析方法的不足，目前尚处于研究探索阶段，目前仅用于血液回输，红细胞生成素，生长激素，绒毛膜促性腺激素，睾酮等的测量。,3.头发,在法医，毒性分析中已有较长历史，但在兴奋剂研究中是才兴起研究方向。有采样容易，无损伤，不易作弊的特点，备受关注。皮质类固醇在体内消除很快，如果赛前停药，尿液分析就检测不到，而发样分析仍可检出。,4.体液,检测步骤,一、筛选方法 （1）挥发性含氮化合物组： 主要检测
10、刺激剂。这类药物多以游离形式排出。 （2）难挥发含氮化合物组： 主要检测麻醉阵痛剂和-阻断剂。这两类药物多以结合形式排出，因此需先水解，使之游离，再进行衍生化后检测。 （3）利尿剂组： 药物经提取后用高效液相色谱法分析检测，此组同时检测2种兴奋剂、咖啡因和匹莫林。 （4）甾体同化激素组： 此类药物有的以游离形式，有的以结合形式排出，我们所用的方法为同时检测。,二、确证方法 经筛选判为阳性的尿样，需进一步加以确证，根据规定，确证结果须给出药物或其代谢物的质谱图，因此在确证方法中均使用气相色谱法-质谱联用仪，确证时的分组同筛选方法中所述。 （1）挥发性含氮化合物组 方法同筛选，最后之提取物浓缩后进
11、样于GC/MSD。 （2）难挥发含氮化合物组 方法同筛选，最后之衍生化产物取小量进样于GC/MSD。 （3）利尿剂组 此组药物需衍生化，然后进样于GC/MS （4）甾体同化激素组 方法同筛选，唯最后得出全质谱图作为确证。,检测步骤,中国兴奋剂检测中心座落在北京国际奥林匹克体育中心内,自1989年得到国际反兴奋剂机构(WADA)的承认后，连续15年通过资格考试。该中心掌握了目前最先进的检测技术，包括高分辩率质谱、同位素质谱、EPO血检、尿检等方法，同时承担WADA赛外检测任务和周边国家的抽样检测任务，检测数量达到每年8000份.,Thank You !,合成类固醇及2激动剂,共27种。合成类固醇
12、又称为甾体同化激素，是雄性激素衍生物。这类药物有增长肌肉的作用，为很多运动员口服或注射使用，但副作用也很严重，会干扰人体的自然激素平衡，男人服用后会发生抑制雄性激素分泌，睾丸缩小，胸部扩大，早秃等现象；女人服用后，会发生男性化，肌肉增生，月经失调，毛发增多等现象。有些作用还是不可逆的。过多地使用这类药物还会引起严重的肝、肾损伤、并发肝癌及心脏病症等。 这类药物中的睾酮是人类自然分泌的一种激素，所以规定要测定睾酮与其异构体表睾酮之比值，大于6时可判断为使用了此类药物。另有几种2激动剂，据认为也有类似作用。,肽类激素,绒毛膜促性腺激素（hCG） 促肾上腺皮质激素(ACTH) 人体生长激素（hGH） 红细胞生成素（EPO）,
