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1、实验二 革兰氏染色法与芽孢染色法,（一）目的,了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性 学习掌握革兰氏染色技术，巩固学习光学显微镜油镜的使用方法,一、革兰氏染色法,（二）原 理,革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。 当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂的紫色。 碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。 当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。 革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性
2、降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的紫色。 革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。,（三） 材料,菌种 大肠杆菌，金黄色葡萄球菌 染色剂 结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液。 仪器或其他 显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、蒸馏水、香柏油、二甲苯。,（四） 实验步骤,镜检,制片（涂片干燥固定）,染色（初染媒染脱色复染）,初染,滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于玻片的
3、涂面上，染色12min ，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。,脱色,用卢戈氏碘液媒染约l min ，水洗。,媒染,用吸水纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时（2030），立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。,复染,在涂片上滴加番红液复染约3min ，水洗，然后用吸水纸吸干。,乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。 脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌； 脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。,镜检,干燥后，用油镜观察。 菌体被染成紫色的是革兰氏阳性菌（G+）； 菌体被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。,Gram Stain of Staph
4、ylococcus aureus,Gram Stain of Escherichia coli,A Gram Stain of a Mixture of Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria.,枯草芽孢杆菌,乳酸杆菌,注意事项 1. 取菌时要严格无菌操作，接种环每取一次菌种后，都要及时灭菌。 2.细菌涂片要薄，镜检以分散开的细菌的颜色为准，过于密集常常呈假阳性。 3.严格控制染色和脱色时间,（五） 实验结果,记录两种细菌（大肠杆菌，金黄色葡萄球菌）观察结果，绘出两种细菌油镜下的染色视野图。注明物镜放大倍数及总放大倍数。,二、细菌芽孢染色法,（一)目的
5、,学习并掌握芽孢染色法。,(二)原理,芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。 芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难。因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿（malachite green）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢。进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。若再用复染液（如番红液）处理，则菌体和芽孢易于区分。,(三)材料,菌种： 枯草芽孢杆菌 染色剂： 孔雀绿染液，番红染液。,(四)操作步骤,（1）将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。 （2）将固定好的
6、涂片装入装片架，置于染色缸中的孔雀绿染液中。 （3）加热染液,近沸腾时开始计时约1015分钟。 （4）取出涂片，待冷却后，水洗，至孔雀绿不再褪色为止。 （5）用番红染液复染1分钟，水洗。 （6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。,芽孢染色法染色结果：位于红色细胞内绿色的为芽胞,注意： 在孔雀绿染色液加热染色时，电热炉应放地上，而不要放到桌面上加热，加热时注意安全。 在孔雀绿染色液加热染色结束后，关闭电炉，注意不要在高温时徒手拿下染色缸，以免烫伤及浪费染液。 取出玻片后，要待冷却才能用水冲洗。,(五)实验报告,绘制油镜下观察到的结果 （表示出观察到的芽孢杆菌的芽孢形状、大小及着生位置）,（六）思考题 你认为哪些环节会影响革兰氏染色和芽孢染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？,1、实验结束注意物品归位。 包括显微镜、使用药品、试剂等。拨下显微镜电源插头,将线绕在镜架上，记录本放于载物台上 2、实验凳子放于台下靠里,养成良好的实验习惯，将使你终生受益！,破伤风梭菌,枯草芽孢杆菌,芽孢,涂片,
