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1、综合性、设计性实验内容 热激诱导的玉米幼苗耐热性观 及其生理生化机制研究,第一部分 实验背景,Mechanical stimulation,Biotic stress,Touch,Wind,Rain,Wound,Mechanical stimulation,Braam 2005,返回,Biotic stress,返回,Haley 1995,Yahraus1995,Garces 2001,H2O2,Ca2+,NO,Borsics 2001,Polisensky 1996,Braam 1992,植物细胞中ROS产生途径,Oxalate oxidase,APX,GR,Decomposation,CA
2、T,氧化还原平衡,6090%,1040%,H2O2,O2.-,OH.,1O2,1mSmin,4mS,2mS,1nS,第二部分 植物材料的培养、热激和热处理,植物材料的培养 品种为晴3或鲁玉13的玉米种子（购于西山种子公司） 用0.1% HgCl2消毒10 min后 用蒸馏水漂洗干净 用蒸馏水于26下吸涨12 h 播于垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘（24cm16cm）中 于26下暗萌发60 h 计算发芽率 选取长势一致的玉米幼苗做以下处理（去除较矮或较高的玉米幼苗）。 热激 把上述玉米幼苗经42热激处理4 h并于26恢复培养4 h后。对照组（未热激）玉米幼苗仍在26下继续培养8 h。,热处理 恢复
3、后，然后把经热激和未热激的玉米幼苗转入47下高温处理1417 h（白磁盘加盖）。 伤害率和存活率测定 处理结束后，先观察伤害率（胚芽鞘明显变褐），在把玉米幼苗转到26下恢复培养7d，每天光照12 h，然后计算存活率（以恢复培养过程中能够转绿并恢复生长的玉米幼苗视为存活的幼苗）。,第三部分 生理指标的测定,一、热激诱导的玉米幼苗耐热性部分 生理指标的测定,伤害率 存活率 组织还原力（还原力） 膜伤害-丙二醛（）含量,直接观察统计,Heat,Salt,Drought,Heavy metal,532nm,440nm,返回,、伤害率的测定,返回,、存活率的测定,返回,植物组织活力测定方法参考文献,、组
4、织活力的测定,原理 有活力的植物组织由于呼吸作用的存在，底物脱下来的可以形成NADH2或NADPH2,无色的TTC（红四氮唑）可以被前者还原为红色的TTF（三苯基甲潜），其最大光吸收为485 nm。 测定：分别取48高温处理17 h 实验组和对照组的胚芽鞘0.g 加入5 ml 0.6% TTC溶液（用50 mmol/L PBS,pH7.0配制）抽气使TTC渗入组织27,15 h 去除TTC溶液着色的胚芽鞘加入少许石英砂和95%乙醇充分研磨提取TTF80水浴10 min 冷却后定容到25 ml 测定OD485 用OD485.g-1FW表示组织活力。返回,、MDA含量的测定,原理 植物在遇到干旱、
5、高温、低温、盐渍以及衰老等情况下，植物体内H2O2、O2.-、OH.等活性氧(reactive oxygen species, ROS)大量积累（返回），导致膜脂过氧化而积累MDA,因此MDA常作为植物逆境伤害指标。 在酸性条件下MDA与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成粉红色化合物，此化合物在532 nm处有最高吸收峰，=155 mM-1.cm-1。,MDA提取：分别取0.5 g实验组和对照组的胚芽鞘加入3 mL 5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂充分研磨用2 mL 5% TCA洗研钵5000 rpm离心10 min 上清液定容至10 mL。 测定：分别取上清液各2 mL 加入0.6%TBA（用
6、20% TCA配制） 2 mL煮沸15 min冷却后分别测定OD600和OD532。ASA测定。 计算：,返回,二、热激诱导的玉米幼苗耐热性的可能机制,抗氧化酶系统，包括过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）等。 抗坏血酸含量的测定 脯氨酸（Pro）含量的测定 蛋白质含量的测定,抗氧化系统测定实验背景,CAT、APX、POD、PPO是植物体中非常重要的末端氧化酶， CAT、APX、 POD可以清除植物体内多余H2O2，PPO可以把酚类物质转变为醌，后者对病原微生物起重要的抑制和杀伤作用。因此，它们在植物抗病性、抗热性等抗逆性中起着非常重要
7、的作用，是植物抗逆性的重要生理指标。,高O2亲和力，占耗氧量80%,PPO，抗病及伤，对O2亲和力弱,APX，抗逆性,乙醇酸氧化酶,黄素氧化酶，对温度不敏感,对O2亲和力极低,CAT，抗逆性,POD，抗逆性,SOD，抗逆性,NADH/NADPH,FMN,UQ,cytb,cytc1,cytaa3,O2,交替氧化酶，抗CN-,抗氧化酶与植物抗逆性关系,抗氧化酶动力学曲线,植物抗氧化酶提取和测定参考文献,返回,、四种抗氧化酶的提取,分别取0.5 g实验组和对照组的胚芽鞘加入少许石英砂和3 ml提取液（50mmol/L PBS, pH7.0,内含0.mmol/LEDTA, 0.2 mmol/L ASA
8、,1%PVP） 充分研磨 转入离心管中用2ml提取液洗研钵 10000 rpm离心10 min 上清液定容至5 ml 测定四种酶活性或分装后转至-20或-80保存。,2、CAT和APX活性的测定,原理 H2O2和ASA分别在240和290 nm处有最高吸收峰，它们的毫摩尔吸收系数分别为0.0和2.8 mM-1cm-1。因此，可以用单位时间内H2O2或ASA的消耗量分别表示CAT或APX活性。 CAT活性测定：反应混合液（ 50mmol/L PBS,pH7.0,内含mmol/L H2O2 ）2.9 ml加入50 ml酶液25预热 min 加入600 mmol/L H2O2 50ml 启动反应分别
9、读出反应0.5 min和3.5 min的OD值求出OD240。,APX活性测定： 反应混合液（ 50mmol/L PBS, pH7.0,内含1 mmol/L ASA ）2.9 ml加入50 ml酶液25预热 min 加入60 mmol/L H2O2 50ml 分别读出反应10 Sec和60 Sec的OD值求出OD290。,3、POD和PPO活性的测定,原理 1、愈创木酚（4-邻甲氧基苯酚） + H2O2 四邻甲氧基苯酚 （Amax = 470nm， = 26.6 mM） 2、邻苯二酚 邻醌 （Amax = 410nm） POD测定：取POD反应混合液（10 mmol/L愈创木酚，5 mmol/
10、L H2O2,用PBS溶解）2.95 ml，加入酶液50 ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，反应3 min，测出A470。,PPO测定：取PPO反应混合液（ 20 mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）2.8 ml，加入酶液0.2 ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，反应 2 min，测出A410。 以每分钟A值变化0.01所需要的酶液的量为一个活力单位（U），则：,、抗坏血酸含量的测定,原理：还原型抗坏血酸（ASA）可把Fe3+还原为Fe2+，后者与红菲罗啉反应形成红色螯合物，最大光吸收为534 nm 抗坏血酸的提取：同MDA提取 ASA测定：1 ml样品加入1 ml 5
11、%TCA1 ml无水乙醇摇匀0.5 ml 0.4% H3PO4乙醇1 ml 0.5% 红菲罗啉（BP）乙醇0.5 ml 0.03% FeCl3乙醇30水浴30 minOD534,DASA测定： 1 ml样品加入0.5 ml 60 mmol/L DTT 乙醇0.5 ml Na2HPO4NaOH混合液使溶液的调至78室温10 min0.5 ml 20% TCA把调到12按上述方法测定 标准曲线的制作：以5%TCA为溶剂配制2，4，6，8，10 mg/ml ASA按上述方法制作标准曲线或根据K = 0.187 (mmol/L)-1cm-1计算,脯氨酸测定实验背景,植物在遇到干旱、高温、低温、盐渍等逆
12、境胁迫情况下，植物体内通过蛋白质的降解、从头合成和降低脯氨酸氧化酶活性等途径合成脯氨酸（Proline, Pro）,Pro具有保护蛋白质（酶）、降低植物细胞水势、清除ROS等复杂的生理功能，从而提高了植物对逆境的抵抗能力。,Pro具有保护蛋白质（酶）、降低植物细胞水势,清除ROS,Pro提取与测定方法参考文献,、Pro含量的测定,原理 植物在遇到干旱、高温、低温、盐渍等逆境胁迫情况下，植物体内通过蛋白质的降解、从头合成和降低脯氨酸氧化酶活性等途径合成脯氨酸（Proline, Pro）,从而提高了植物对逆境的抵抗能力。 在酸性条件下与茚三酮发生反应生成红色化合物，此化合物在520 nm处有最高吸
13、收峰，= 3.24mM-1.cm-1 。,Pro的提取：分别取0.5 g实验组和对照组的胚芽鞘加入3 mL 3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂充分研磨用2 mL 3% SSA洗研钵10000 rpm离心10 min 上清液定容至5 mL。 测定：上清液各2 mL 分别加入2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮试剂煮沸15 min冷却后分别测定A520 计算：,595 nm,465 nm,G250,G250蛋白质复合物,返回,、蛋白质含量的测定,原理：考马斯亮蓝的最大光吸收为465 nm，它与蛋白质结合后最大吸收峰转移至595 nm，并且反应迅速（2 min），稳定性好（1h）。 蛋白质的提取：同抗氧化酶的提取。 测定方法考马斯亮蓝染色法：0.1 ml上清液加入 ml 0.01%考马斯亮蓝G250摇匀测定OD595。,计算：根据= 0.0083(ug/ml)-1.cm-1计算蛋白质含量（mg.g-1FW）。 G250试剂： 100 mg G250用50 ml 95%乙醇溶解加入100 ml 85%磷酸摇匀用蒸馏水定容至1000 ml 室温下贮存于棕色瓶中。,附：722S分光光度计的使用方法,调“0”,调“100”,测定,722S使用,
