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1、学位论文独创性声明本人郜字声明，所呈交的学位论文系在导师陈丽教授指导下本人独立完成的研究成果。文中任何引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人己用于其他学位申请的论文或成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。本文如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果：、交回学校授予的学位证书；、学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报；、本文按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害，进行公开道歉。、本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。论文作者签名：魄年年厶堑日学位论文版权使用
2、授权书本人完全了解山西医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山西医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为山西医科大学。（保密论文在解密后应遵守此规定）论文作者签名：指导教师签名：（本声明的版权归山西医科大学所有，未经许可，任何单位及任何个人不得擅自使用）刖吾感染性休克是指由微生物及其毒素等产物所引起的脓毒病综合征伴休克。感染灶中的微生物及其毒素，
3、胞壁产物等侵入血循环，激活宿主的各种细胞和体液系统；产生细胞因子和内源性介质，作用于机体，导致组织细胞缺血缺氧、代谢紊乱、功能障碍、甚至多器官功能衰竭。它是当前危重病患者死亡的主要原因之一。尽管最近几十年在液体复苏、抗生素治疗、生命体征监测和生命支持技术等方面均取得长足进展，对败血症，感染性休克的本质也有了更深刻认识，但其发病率和死亡率依然居高不下。感染性休克发生的根本原因是各种病原微生物的侵入。当病原微生物入侵宿主后，释放出多种致病因子，如革兰阴性菌脂多糖（）、革兰阳性菌磷壁酸（）和肤聚糖等，进而激活机体的内源性炎性反应，即触发全身性炎性反应综合症（，）。各种炎性介质的释放是的主要特征，肿瘤
4、坏死因子（，）是此期间所产生的最重要细胞因子之一，它所引起的血管内皮细胞凋亡严重影响循环系统并且加重休克。凋亡蛋白酶一是细胞凋亡时所产生的种半胱氨酸蛋白酶，与凋亡的关系最为密切，在细胞凋亡中起执行凋亡的作用。丙泊酚作为一种静脉麻醉药，具有起效快，作用时间短，苏醒迅速而完全，不良反应少等优良特点而被广泛用于临床各科手术麻醉及镇静治疗。它可直接清除自由基，抑制细胞线粒体膜通透性转换孔（）开放抑制脂质过氧化反应调节钙离子平衡，降低组织氧耗，并可增加细胞内谷胱甘肽含量。从而直接阻断凋亡发生的生化反应。本研究采用人脐静脉血管内皮细胞株体外培养技术，建立血管内皮细胞凋亡模型，旨在观察不同浓度的丙泊酚抑制血
5、管内皮细胞凋亡的作用，进一步探讨丙泊酚的保护作用机制。材料与方法、材料实验用细胞：人脐静脉血管内皮细胞株购自南京凯基生物有限责任公司。主要设备：培养箱超净工作台苏洲汉达工业自动化有限公司倒置显微镜日本光学仪器株式会社台式高速离心机流式细胞仪图像分析系统上海医用分析仪器厂四川川大智胜软件股份有限公司山西医辩丈学硬士学位论文药物及试剂：试剂名称丙泊酚（得普利麻）生产厂家公司，批号是肿瘤坏死因子（）公司一一抗体美国公司试剂盒试剂盒培养液胎牛血清胰蛋白酶细胞培养瓶六孔细胞培养板北京中杉金桥生物技术有限公司北京中杉金桥生物技术有限公司德国罗氏诊断公司公司杭州四季青生物工程材料有限公司公司上海生物工程有限
6、公司上海生物工程有限公司液、流式缓冲液等均用市场分析纯试剂配制。实验方法体外培养及鉴定采用胰蛋白酶消化法建立体外培养，细胞于塑料培养皿中生长较快。一般过夜后大部分细胞即贴壁并生长。将按密度接种于培养瓶中，使用含胎牛血清的培养液，在，。（培养箱中孵育，待细胞贴壁融合成单层细胞时倒掉培养瓶中的培养基，换甩无血清的培养液培养，用台盼蓝染色少量细胞悬液记数活细胞在以上。根据倒置显微镜下细胞呈单层鹅卵石样排列，采用形态学及抗因子抗体免疫荧光染色行内皮细胞鉴定（荧光免疫组化方法）。具体方法如下：培养瓶中的细胞融合成铺路石状单层时，将细胞消化下来，接种入预先用明胶包被的盖玻片上，待细胞生长至适宜密度时，终止
7、培养。）反复冲洗：）丙酮固定）将盖玻片取出，玻片晾干；）在盖玻片上滴加兔抗人因子相关抗原诊断血清（：稀释），于下孵育：）用（）冲洗浸泡；）晾干后滴加羊抗兔荧光抗体（：稀释），于孵育）用冲洗浸泡，晾干：山西医科大学硕士学位论文）甘油封片；）荧光显微镜观察，照相。内皮细胞膜表面的因子相关抗原为其特有的抗原。用因子相关抗原的特异性单克隆抗体荧光免疫组化染色法，可检测到培养的人脐静脉内皮细胞因子相关抗原为阳性（见图）。在荧光显微镜下扫描，人脐静脉内皮细胞核周胞浆呈较强黄绿色荧光，呈颗粒状存在或弥散分布，而背景无荧光显示。表明因子相关抗原存在，所分离培养的细胞为血管内皮细胞。从而在实验材料上确保实验结果
8、的可靠性。实验模型的制备及分组将人脐静脉内皮细胞培养至细胞呈融合状态，随机分为组，接种于六孔培养板上，每组六孔。加入培养液进行培养。丙泊酚浓度用表示，单位是。组（）：组（）：组（；组（）：组（；组（）。按上述分组，在相应组中加入不同浓度的丙泊酚，于培养箱内孵育，再在相应组中加入终末浓度为脚，置于培养箱中。细胞凋亡的检测将分离好的人脐静脉血管内皮细胞接种在孔培养板中，适当加入含有胎牛血清的培养液，并用记数板调整细胞浓度为，放入培养箱中培养使培养板中的人脐静脉血管内皮细胞均匀地贴壁生长。加入无血清培养液进行同步化，使绝大多数细胞处于静止期。按照上述分组及浓度先加入丙泊酚，于培养箱内孵育，再在相应组
9、中加入终末浓度为，置于培养箱中。收集各组细胞，用滴管将培养孑中的培养液吸去，用液冲洗一遍，吸去冲洗液，再加入胰蛋白酶进行消化，密切观察细胞的形态，当细胞形态由铺路石样变为圆球形时，说明细胞已不再贴壁，应加入培养液终止消化。然后用滴管轻轻吹吸培养孔中的培养液，使细胞均匀悬浮在培养液中，用移液管将各组细胞悬液移入离心管中，以转分离心，分别倒掉上清，加入液，用震荡器混匀，目尼纶网过滤，再以转分离心，弃上清；再加入液重复一遍。最后加入缓冲液，调整细胞浓度为一。在培养管中加入细胞悬液（约为个细胞）。加入纯化的重组山西医科大学磋士学位论文。轻轻混匀，室温反应。加入及碘化丙啶（，轻轻混匀，室温避光处反应。各
10、实验管中分别加入缓冲液，上机，流式细胞仪采集数据，并用专用软件分析，通过计数凋亡区细胞数量得出凋亡指数（）。细胞涂片的制备将分离好的人脐静脉血管内皮细胞接种在底部放有经多聚赖氨酸处理过的的载玻片的孔培养板中，适当加入含有胎牛血清的培养液，放入培养箱中培养使培养板中的人脐静脉血管内皮细胞均匀地贴壁生长并基本铺满载玻片。加入无血清培养液进行同步化，使绝大多数细胞处于静止期。按照上述分组。在相应组中加入不同浓度的丙泊酚，于培养箱内孵育，再在相应组中加入（终末浓度为，放入培养箱中继续培养，取出载玻片用洗三遍并用丙酮固定分钟，做好标记在冰箱中保存。免疫细胞化学染色实验的重要步骤为：）将盖玻片置入玻璃皿内
11、，加丙酮脱水：）去离子水孵育，阻断内源性过氧化物酶；）根据所应用的一抗的特殊要求，对细胞爬片进行预处理。蒸馏水洗次，洗次，每次分钟；）滴加兔来源的一抗（：稀释），孵育小时，冲洗，分钟滔次。滴加羊抗兔抗体一多聚体，孵育分钟，冲洗，分钟次；）选用显色，镜下观察控制反应时间，适时终止反应，棕黄色颗粒状产物为阳性标记：）蒸馏水充分冲洗；）苏木素复染，脱水、透明，用二甲苯进行封片；）光镜下观察并照相，采集图象；）实验中采用代替一抗作为阴性对照。对免疫组化染色的涂片进行图像分析，采用图像分析系统，计算阳性单位值（）。统计学方法数据以表示，采用统计软件，经检验各组方差齐，组间比较用单因素方差分析和一箍验，认为差异有统计学意义。结果显徽镜下细胞形态变化：、两组细胞状态良好，生长旺盛，形态饱满，其余四组细胞在干预小时后，倒簧显微镜观察到不同程度细胞密度降低，细胞膜通透性增高，细胞体积缩小、核深染、山西医辩大学硕士掌位论文核碎裂。各组血管内皮细胞凋亡指数比较结果：流式细胞仪检测结果显示组细胞凋亡指数
