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1、RNAI技术及其应用提要：RNA干扰(RNA interference ,RNAi) 现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA 存在同源互补序列的双链RNA(double strand RNA ,dsRNA) 导入细胞后,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失,这一过程属于转录后基因沉默机制( posttranscriptional gene siliencing , PTGS) 范畴。RNAi 广泛存在于生物界,从低等原核生物,到植物,真菌,无脊椎动物,甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象,只是机制也更为复杂。RNA干涉(RNAi
2、)是近年发展起来的一种阻抑基因表达的新方法，该技术通过双链RNA的介导，可以特异性地阻断或降低相应基因的表达。在肿瘤研究中，通过RNAi技术可以选择性地抑制人类肿瘤相关基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的生长。该技术的应用为癌症的基因治疗提供了新的方法。癌基因的激活认为是肿瘤发生的根本原因之一，各种癌基因都可以成为肿瘤基因治疗的靶点。利用基因家族中多个基因具有同一段同源性很高的保守序列这一特性,针对这一区段序列设计相应的siRNA，通过体外合成或构建在体内表达siRNA的载体的方法转入细胞中，可以特异性的封闭这些基因的转录产物而不影响其他基因的表达。作用机制：RNAi 的作用机制. RNAi 的第一
3、步是,dsRNA（双链RNA） 在内切核酸酶(一种具有RNase 样活性的核酸酶，称为Dicer.) 作用下加工裂解形成2125 nt （核苷酸）的由正义和反义序列组成的干扰性小dsRNA ,即siRNA。果蝇中RNase III 样核酸酶Dicer 含有解旋酶(helicase) 活性以及dsRNA 结合域和PAZ 结构域. 已发现在哺乳动物中也存在Dicer 同类物.近年来研究发现,干扰性小RNA(siRNA) 是RNA 干扰作用(RNAi) 赖以发生的重要中间效应分子. siRNA 是一类特殊双链RNA(dsRNA) 分子,具有特征性结构,即siRNA 的序列与所作用的靶mRNA 序列具
4、有同源性; siRNA 两条单链末端为5端磷酸和3端羟基. 此外,每条单链的3端均有23 个突出的非配对的碱基。细胞中dsRNA的形成是RNAi 的第一步. 获得dsRNA. 主要有三种途径：一：细胞内产生的mRNA在RNA聚合酶的作用下，依一条单链的RNA合成一条双链RNA；二：体外人工合成，原理类似于上；三：有一些长的RNA具有反向互补序列，它会自己和自己互补，产生一个茎环结构，这个结构很容易被核酸内切酶识别，但是核算内切酶只降解单链部分，互补的双链RNA被留下来。在线虫( C. elegans) 可以直接注射dsRNA 或把线虫浸泡在含dsRNA 溶液中等方式引入外源dsRNA ,还可以
5、通过喂养表达正义和反义RNA 的细菌RNAi 的第二步是, siRNA与特定的酶结合形成RNA诱导的沉默复合物RISC(由siRNA 中的反义链指导形成)，RISC复合物中含siRNA、核酸内切酶、核酸外切酶以及解旋酶同源RNA 链搜索活性等，其中的siRNA解链成为单链，由其中的反义链识别与其同源的靶mRNA，并与靶mRNA配对结合，在mRNA的近中点位置将靶mRNA切割，并由RISC中的酶把靶mRNA降解，从而阻断了mRNA传递遗传信息的功能。siRNA 可作为一种特殊引物,在RNA 依赖RNA聚合酶(RdRp) 作用下以靶mRNA 为模板合成dsRNA ,后者可被降解形成新的siRNA
6、;新生成的siRNA又可进入上述循环. 这种过程称为随机降解性多聚酶链反应(random degradative PCR) . 新生的dsRNA 反复合成和降解,不断产生新的siRNA ,从而使靶mRNA 渐进性减少,呈现基因沉默现象. RdRp 一般只对所表达的靶mRNA 发挥作用,这种在RNAi 过程中对靶mRNA 的特异性扩增作用有助于增强RNAi的特异性基因监视功能. 每个细胞只需要少量dsRNA 即能完全关闭相应基因表达,可见RNAi 过程具有生物催化反应的基本动力学特征.（在植物和线虫中存在的信号放大过程，但是在哺乳动物中不存在这种现象,可能与在哺乳动物体中siRNA不能作为RdR
7、的引物有关。）此外，：解开siRNA的双链后，反义RNA链能作为双链RNA合成的一个引物，以mRNA为模板， (RNA dependentRNA polymerases，RdRPs，又称作RDRs)的作用下形成新的dsRNA，并再次被Dicer识别并切断后形成新的siRNA，这种新产生的siRNA(次级siRNA,secondary siRNA)又可形成更多的RISC复合物并作用于mRNA，使mRNA降解。因此小剂量的dsRNA即可诱导强大的PTGS，即PTGS具有类似于激素作用或PCR那样的级联放大效应。最新的研究进一步揭示,ATP 在siRNA 介导的RNAi 中具有重要作用. 较长dsR
8、NA 向siRNA 的转变要有ATP 参与. siRNA 与蛋白因子形成一个无活性的约360 kD 的蛋白PRNA 复合体;随之, siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白PRNA 复合体(RISC) ,此步具有ATP 依赖性. RISC 活性复合体对靶mRNA 的识别和切割作用,这一步可能不需ATP参与. 此外,ATP 使siRNA 5端带上磷酸分子,且对siRNA 的功能具有重要作用. 上述过程中siRNA 双链结构解旋很可能是一种稳定的结构改变,因为siRNA 双链体与细胞裂解物、ATP 等孵育后再除去ATP 及其它辅助因子,含有siRNA 的活性复合体仍能识别和切割靶mRNA 分子引自
9、 Gregory J.Hannon(2002) Nature,418,244-2512 RNAi的分子抑制机制 2.1 转录抑制 与RNAi有关的dsRNA及蛋白质可参与染色质的修饰作用，使其中的组蛋白和DNA发生甲基化作用，使相应基因不能被转录，从而导致受阻基因不能表达。这种在转录水平上阻断基因功能，使基因沉默的RNAi方式被称为转录基因沉默(Transcriptional gene silencing,TGS)。这种现象先在植物中得到证实,但是在哺乳动物中是否存在仍有争议。2004年Svoboda等研究表明，在小鼠卵母细胞中，通过RNAi引起靶基因表达沉默的长dsRNA不能引起相应DNA区
10、域从头合成DNA的甲基化。Morris等也于同年得出实验结论，针对内源基因启动子的siRNA能够引起其区域内CG岛以及组蛋白H3K9的甲基化，从而在转录水平抑制基因的表达。 2.2 转录后抑制不同来源的dsRNA通过各种转基因技术转入植物、线虫或哺乳动物细胞内，、被切割产生siRNA片断，再由合成的RISC切割靶mRNA从而阻断基因表达。这种基因能正常转录成mRNA，但mRNA因被降解使基因功能被阻断，这种RNAi方式叫做转录后沉默(Posttranscriptional gene silencing,PTGS)。 siRNA对靶mRNA降解具有序列特异性，只能引起同源mRNA降解，如果siR
11、NA与mRNA有一个bp不配对，RNAi作用就极大降低，如果两者有4个bp不配对，就不能产生RNAi。 2.3 翻译抑制在细胞中存在内源性小片段单链RNA(ssRNA)，其长度也在2125 nt之间，这种ssRNA可与mRNA的3非翻译区(3UTR)特异性地结合，从而抑制mRNA的翻译和相应的功能蛋白质合成。这种小片段的ssRNA叫做stRNA(small temporal RNA)。ssRNA的形成是因为当RNA的大小为7080 nt时，容易形成双链的茎环状结构，其双链茎的长度正好在2125 nt之间，这样的双链结构易被Dicer酶识别并切割成stRNA，由stRNA抑制翻译。这种方式的RN
12、Ai也作用于转录后形成的mRNA，它在调节生物细胞内基因的表达、自身的发育方面起着重要的作用。MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约2025个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。最近的研究表miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。miRNA 与siRNA 的区别：（1） miR
13、NA是单链的，而siRNA则是双链的；（2） miRNA参与正常情况下生长发育基因调控，而siRNA不参与动物体的正常生长，只有在病毒或其它dsRNA诱导情况下才产生siRNA,作为miRNA的完善和补充；（3） miRNA在转录后水平调节基因表达，推测在翻译水平也起作用，而siRNA为转录后水平调节基因表达调控；（4） Dicer酶对两类RNA的加工过程，miRNA为不对称性，仅来自含茎环结构RNA前体的一侧臂，剩余部分很快降解，而这种不对称性不存在于而siRNA加工过程中。.设计流程：1.目的基因的确定（1）、检索文献获取有实验证明有效的靶点序列（核对）（2）、http:/www.ncbi
14、.nlm.nih.gov/（3）、http:/ or http:/2、设计siRNA序列在制备siRNA 前都需要单独设计siRNA序列。研究发现对哺乳动物细胞，最有效的siRNAs是21-23个碱基大小、3端有两个突出碱基的双链RNA。siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。 （1）、选择siRNA靶位点： 从转录AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA 3端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。 Tuschl等建议在设计siRNA时不
15、要针对5和3端的非编码区（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结 合mRNA从而影响siRNA的效果。 （2）、序列同源性分析:将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）选出合适的目标序列进行合成。并非所有符合条件的siRNA都一样有效，其原因还不清楚，可能是位置效应的结果，因此对于一个目的基因，一般要选择3-5个靶位点来设计siRNA。通常来说，每个目标序列设计34对siRNAs，选择最有效的进行后续研究。（3）siRNA表达框架是一种由PCR反应得到能在细胞内表达siRNA的DNA模板，其结构为RNA pol III启动子-表达siRNA的发夹状结构序列RNA pol III，所获得的PCR产物可直接导入细胞。该方法最为简易省时，适用于筛选siRNA及在不同宿主细胞中转录启动子与siRNA靶序列的最佳组合。（4）实验对照设置：实验对照是衡量RNAi.实验数据可信度的一个重要因素。设立阳性对照目的是通过检测不同浓度的siRNA转染效率及其最终干扰效果，来确定合适的转染
