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1、第十二章 淋巴细胞活化的分子机制以及应答过程,淋巴细胞活化是指淋巴细胞在抗原或致分裂原刺激下所发生的一系列细胞生物化学变化过程，包括细胞活化信号的传递、多种相关酶的活化。 细胞最终分裂成子代淋巴细胞并分化成熟为各种亚群的淋巴细胞，发挥各自的免疫功能。,第一节 细胞信号传递系统的分子基础,细胞的信号传递系统可以概括为受体-信号放大器-效应器三大组成部分。受体负责识别和接收外界信号或刺激，继而激活胞内信号放大系统，再由胞内信息分子将转导后的信号传递至靶分子，引起包括酶活性、基因表达、膜通透性改变等一系列生理或病理效应。 在上述复杂的信号传递系统中，蛋白质（即信号分子）的可逆性磷酸化作用就如同“分子
2、开关”一样，调节信号传递途径的畅通无阻。,信使分子按其功能大致可分为三类：,第一信使：指细胞外的信息分子，如激素、CKs等。 第二信使：胞内的信息分子称为第二信使，包括cAMP、cGMP、Ca2+、DAG、NO、神经酰胺等。 第三信使：指一类专在胞浆和细胞核之间进行信息传递的信使分子。它们多半是DNA结合蛋白或转录调控因子，参与基因的表达调控。这类核蛋白又称之为“核内第三信使”。,第二节 细胞信号传递过程中所涉及的酶 和接头蛋白,一、蛋白酪氨酸激酶,蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase, PTK)是一类催化ATP上-磷酸转移到蛋白酪氨酸残基上的激酶，能催化多种底物蛋白
3、质酪氨酸残基磷酸化，在细胞生长、增殖、分化中具有重要作用。 迄今发现的蛋白酪氨激酶中多数是属于致癌RNA病毒的癌基因产物， 也可由脊椎动物的原癌基因产生。 根据PTK是否存在于细胞膜受体可将其分成非受体型和受体型。,（一）非受体型PTK,Src家族：包括p60src、p56lck、p59fyn、p59yes、(p62yes)、p56lyn、p59hck、p55fgr和p55blk等。 Syk家族：包括Syk和ZAP-70 Tec家族：包括Btk、Tec、Itk、DSrc29、Etk和Rlk。 这些PTKs缺乏胞外及跨膜序列，因此通过其N末端与细胞膜表面蛋白的胞浆内结构域相连接，从而发挥信号转导
4、作用。,1Lck p56lck是分子量为56kDa的单链分子，由509个氨基酸残基组成。 Lck分子结构可以分为四个功能区: 膜接触区，位于N-端，N-端第2位Gly能结合豆蔻酸，通过豆蔻酸(myristic acid)与细胞膜内侧面相连； 底物作用区，包括SH2和SH3结构域； 激酶活性区，即SH1结构域，这一区域在氨基酸组成上与其它src家族成员高度同源。其中273位的赖氨酸（Lys）是ATP结合点，394位的酪氨酸（Tyr）为自身磷酸化位点； 调节区，位于羧基端，与Lck激酶活性的调节有关。Tyr505是调节性磷酸化位点。,调节区在静止细胞中，Lck 在Tyr505上发生磷酸化， 但当细
5、胞活化时这个残基则发生去磷酸化，随之发生激酶的活化以及Tyr394的自身磷酸化。 目前研究认为，CD45通过使Tyr505去磷酸化对Lck起正调控作用； 而p50csk是使Tyr505发生磷酸化对Lck则起负调控作用。 CD45和p50csk对其它src家族PTKs也发挥着同样的调节作用。,信号分子的特殊结构域SH结构域：,src同源区2 (src homology 2, SH-2)是一个保守的蛋白序列，约有100个氨基酸残基组成，能够识别蛋白中磷酸化的酪氨酸残基。 src同源区3(SH-3)，为一个保守的氨基酸序列，约含50个氨基酸，可见于多种胞浆信号蛋白以及肌动蛋白结合蛋白中。目前研究发现
6、SH-3识别的部位是一些富含脯氨酸的区域。,2Fyn p59fyn见于多种细胞中。Fyn基本结构类似于Lck。它通过氨基末端豆蔻酸的基团共价结合于胞浆膜内面，Fyn有一个自身磷酸化位点Tyr417，羧基末端有一个负调控功能域，包括含有一个酪氨酸磷酸化位点Tyr528。 Fyn与TCR/CD3链结合，Fyn的活化可引起CD3链的磷酸化。,3Lyn Lyn也是一种主要分布于造血细胞的非受体型PTK。在B细胞中，Lyn参与BCR，CD19和CD40等的信号转导。,4Syk家族 Syk家族有Syk和ZAP70两个成员，二者结构相似，在N端有两个SH2结构域，C端有一个SH1激酶结构域。两个SH2结构域
7、可与多种刺激性免疫受体胞浆区的活化ITAM基序结合，介导多种受体引起的细胞活化信号。Syk家族分子的激活一般晚于Src家族。 （1）Syk Syk（spleen tyrosine kinase）表达于大部分造血细胞，B细胞表达水平最高。 （2）ZAP-70 最早发现与TCR复合体中的CD3链相关，所以称为相关蛋白（associated protein, ZAP-70）。ZAP-70分子量为70kDa，主要表达在T细胞和NK细胞。,（二）受体型PTK,受体型PTK属于I型跨膜分子，胞膜外区一般结构复杂且高度糖基化，可以结合相应的配体。激酶结构位于胞浆区，激酶结构中有一个ATP结合基序。另外，一般
8、在胞浆区含有一定数量的自身磷酸化位点。 根据它们的结构不同，受体型酪氨酸激酶可以分为9种类型,其中较常见的有4种。 受体型酪氨酸蛋白激酶活化后可激活胞浆中多种分子，如STAT、PLC、PI-3K、GAP、Raf等。,二、蛋白酪氨酸磷酸酯酶,T细胞活化中所发生的多种蛋白分子酪氨酸磷酸化提示必需有蛋白酪氨酸磷酸酯酶(protein tyrosine phosphatase, PTP/PTPase)来拮抗这种作用，通过负反馈来维持机体生理功能的平衡。,（一）受体型PTPCD45,1CD45的基本结构与分布 CD45是位于白细胞表面的白细胞共同抗原(leukocyte common antigen,L
9、CA)。CD45可以高水平表达在淋巴细胞以及除了红细胞和血小板之外的其它所有的造血细胞上。CD45为单链跨膜蛋白。 2CD45的异构型 CD45分子一个明显的特点是存在结构和分子量不同的异型(isoform) 。CD45异型产生的分子基础是由于CD45mRNA水平的不同拼接所致，另外由于翻译后糖基化修饰不同，更增加了CD45分子的多样性。 最著名的CD45异构型是CD45R。,3CD45分子的配体 CD22? 4CD45分子的功能 CD45直接参与TCR和BCR介导的活化信号，在淋巴细胞的活化过程中起重要作用。CD45的底物主要是Src家族成员，如Lck、Fyn、Lyn等。静止T细胞中Lck是
10、无活性的，其分子的505位点氨基酸被磷酸化。Lck激酶活性的升高是与Tyr505去磷酸化相一致。 CD45也可使有活性激酶中主要自身磷酸化Tyr394发生去磷酸化，从而引起激酶活性的抑制。,5Ca2+浓度与CD45活化的关系 活化T细胞内酪氨酸磷酸化水平升高与细胞内钙离子浓度升高相关，推测高浓度钙离子可能对CD45具有负调控作用。 抗原同TCR结合，随后CD4和CD45发生共凝集，从而导致CD45介导的p56lck去磷酸化而活化，细胞内钙离子水平的突然升高又可灭活CD45，从而使二级底物发生短暂的酪氨酸磷酸化以及活化信号的传递；随后细胞内钙离子水平又回到最初的水平，CD45也从无活性状态中恢复
11、过来， 使p56lck在Tyr394位点发生去磷酸化而灭活，以及其它能终止信号转导途径起始步骤中起关键作用的酶发生去磷酸化。,（二）非受体型PTP,1SH2-containing tyrosine phosphatase 1 （ SHP-1 ）分布局限，仅表达于造血细胞（红细胞和血小板除外）。SHP-1是造血细胞信号转导中的一种重要的负调控因素。SHP-1的作用机制是：一方面通过SH2结构域与磷酸化的ITIM基序结合；另一方面通过PTP酶活性使底物去磷酸化而被灭活。 2.SHP-2 与SHP-1不同，SHP-2表达十分广泛，在不同的条件下，SHP-2可发挥正的或负的调节作用,三、蛋白丝氨酸/苏
12、氨酸激酶,蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶是机体中分布十分广泛的蛋白激酶，种类繁多，调节机制也十分复杂。此处仅介绍PKC和MAPK。,（一）蛋白激酶C（PKC）,PKC (protein kinase C) 是一类Ca2+、磷脂依赖性的蛋白激酶，在跨膜信号传递过程中起着重要作用。 PKC通过催化多种蛋白质上Ser/Thr磷酸化，调节多种细胞的代谢、生长、增殖和分化。,1PKC的结构和分类 PKC的所有亚类都由一条单肽链组成，分子量大约为6783kDa，其结构可分为四个保守区C1C4(nPKC和aPKC缺少C2区)和五个可变区V1V5。其中C1区可能是膜结合区。此区中的序列与佛波酯和二酰甘油 (DAG)的
13、结合有关。C2区与PKC对Ca2+的敏感性有关。 C1和C2在结构上不同于其它蛋白激酶，能结合Ca2+、磷脂、DAG和TPA，因此C1和C2区又称为调节区。C3区包括一个ATP结合序列，该区域与其它蛋白激酶的ATP结合位点具有很高的同源性，又称催化区。C4区包含一个底物结合区，是识别磷酸化底物所必需的。,2PKC的转位与激活 PKC广泛分布于多种组织、器官和细胞， 静止细胞中PKC主要存在于胞浆中，当细胞受到刺激后，PKC以Ca2+依赖的形式从胞浆中移位到细胞膜上， 此过程称之为转位(translocation)。一般将PKC的转位作为PKC激活的标志。 静止细胞中PKC一般以非活化形式存在。
14、PKC的活性依赖于钙离子和磷脂的存在，但只有在DAG存在下，生理浓度的钙离子才起作用，这是由于DAG能增加PKC对底物亲和力的缘故。 PIP2在PLC作用下水解生成DAG和IP3。IP3促进细胞内钙离子的释放，在激活PKC过程中与DAG起协同作用。,乙酸豆寇佛波酯 (TPA; 或PMA)是一种促肿瘤剂，由于其结构与DAG相似，可在很低浓度下模拟DAG，活化PKC。由于TPA与PKC的结合牢固，使PKC处于持续的激活状态，易导致代谢紊乱。 3PKC的抑制剂 多种化学物质或抗生素对PKC活性具有抑制作用，根据抑制剂作用PKC靶部位的不同可以将抑制剂分为二组: 一组是作用于催化区的抑制剂，它们可与蛋
15、白激酶的保守残基结合，因此对PKC无明显的选择性；另一组是作用于调节区的抑制剂，它们可与Ca2+、 磷脂和二酰基甘油/佛波酯相结合，因而有较高的选择性。,（二）MAP激酶,丝裂原活化的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）是一组可以被多种细胞外信号激活的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶。 MAPK主要参与生长因子、激素、细胞因子、应激等各种刺激下的细胞反应，以及细胞的生长、分化等。 MAPK属于一种Ser/Thr蛋白激酶，可在多种不同的信号转导途径中充当一种共同的信号转导成份，且在细胞周期调控中发挥重要的作用。 在T细胞中有三种主要的MAP激酶，ERK、
16、JNK和p38。,1ERK（extracellular receptor-activated kinase） 当细胞膜受体与配体结合后，通过受体型PTK的作用，使Sos（一种GEF）转位到膜内侧，催化Ras-GTP途径激活，后者作用于Raf，引起丝氨酸/苏氨酸激酶活性激活。Raf引起MEK1和MEK2的丝氨酸磷酸化并使之激活。MEK1和MEK2是双特异性蛋白激酶，可以使ERK1和ERK2的202 204位的TET序列中的酪氨酸和丝氨酸残基发生磷酸化并激活。最终活化的ERK使ELK磷酸化，ELK使c-fos基因转录，Fos蛋白是AP-1的组成成分之一。,2JNK（c-jun N-terminal kinase） JNK是由与Ras平行的Rac-GTP途径激活的。Grb2连接Vav，Vav使Rac-GDP释放GDP，然后Rac连接GTP成为 Rac-GTP，通过MAP激酶的级联反应最终活化JNK，JNK使Jun蛋白磷酸化，Jun是AP-1的另外一个组成成分。 3p
