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1、薄层色谱法分离菠菜叶色素,2012/11/27,1.掌握薄层色谱法的原理、操作方法； 2.利用薄层色谱法对菠菜叶色素进行分离。,一、实验目的,薄层色谱法 薄层色谱法是一种微量、快速和简单的色谱方法，它不仅是一种定性定量分析的重要手段，还是一种有效的分离提纯方法，在有机化学、生物化学和制备分离领域具有广泛应用。 特点：设备简单，操作方便迅速，分离效率高，有较高的灵敏度和灵活性，既适合分离微量样品，又适合于大型制备色谱。,二、实验原理,色谱有三种形式：吸附色谱、分配色谱和离子交换色谱。应用较为广泛的是吸附薄层色谱，即固液吸附薄层色谱，其原理是化合物在吸附剂和展开剂之间进行反复的吸附和解吸附，吸附能
2、力较弱的溶质首先被展开剂解吸下来，随展开剂向前移动较快，而吸附能力较强的溶质解析较慢，随展开剂移动较慢，从而达到分离的目的。,二、实验原理,R甲 = a/c,R乙 = b/c,Rf值测量方法,二、实验原理,1. 吸附剂的选择和薄层板的制备 2. 薄层板的活化 硅胶板，105110烘箱中活化0.5h。 3. 点样 在距薄层板一端约1cm处用铅笔画起始线；配置样品溶液；毛细管点样，斑点直径不要太大。 4. 展开 展开剂的选择原则： I. 展开剂的极性应该对分离的物质有一 定的解吸能力，但不能太大，比被分离物质的极性略小； II. 展开剂对被分离的物质有一定的溶解度。 常用混合溶剂：石油醚乙醚、石油
3、醚乙酸乙酯、环己烷乙酸乙酯等。 5. 显色 紫外灯显色、碘薰显色、显色剂显色。,三、操作方法,活化硅胶板、层析缸、玻璃棒、研钵； 95%乙醇、石油醚（6090 ）、丙酮、菠菜叶。,四、仪器与试剂,直立式层析缸示意图,1. 硅胶板的活化 于烘箱中105110活化0.5h。 2. 菠菜叶绿素的提取 将12片新鲜菠菜叶剪碎放于研钵中研磨，然后加入20ml石油醚乙醇（1:1）混合溶液继续研磨3min，用吸管将萃取液转移至分液漏斗中，用等体积的水洗涤两次，将上层有机相转移至干燥的小锥形瓶中，用无水硫酸镁干燥。 3.分离与鉴定 在经活化的硅胶板一端约1cm 处，用铅笔轻轻划上起始线，用管口平整的毛细管吸取
4、提取液点样，斑点直径约为2至3mm。在层析缸中加入约深0.5cm的展开剂（丙酮:石油醚=1:2），将点好样的硅胶板放入其中进行展开，当展开剂前沿爬至上端约1cm处时，取出硅胶板并立即用铅笔记下溶剂前沿位置，晾干后计算各斑点的Rf值。,五、实验步骤,4. 菠菜叶色素的分离 从上至下依次为：-胡萝卜素、去镁叶绿素a、叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、紫黄质、新黄质、点样点。,五、实验步骤,1. 菠菜叶不可研得太烂而成糊状，否则会造成分离困 难； 2. 用水洗涤萃取液时，不要剧烈振荡，否则容易乳化； 3. 于层析缸中加入展开剂后可摇动几下，令其蒸汽达到饱和； 4. 点样时不要点破硅胶层表面，点样完毕后应先令溶剂挥发后再进行展开。,六、注意事项,七、思考题,1.怎样选择合适的展开剂？展开剂极性太大或是太小会有什么影响？ 2.为什么样品斑点直径约为23mm? 3.展开剂的高度超过点样线，对薄层色谱有什么影 响？ 4.为什么极性大的组分要用极性较大的溶剂洗脱？,
