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1、骨髓间充质干细胞复合多孔纳米羟磷灰石聚酰胺 6整复大鼠颅骨缺损的实验研究【摘要】目的初步探讨纳米羟磷灰石/聚酰胺6(n-HA/PA6)多孔材料对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(BM-SCs)增殖及分化的影响，以及BMSCs作为种子细胞、多孔n-HA/PA6作为支架材料构建组织工程化骨修复大鼠颅骨极限骨缺损的可行性及整复效果。方法矿化诱导的第3代BMSCs与n-HA/PA6多孔材料复合培养，MTT检测细胞增殖，ALP染色检测骨向分化。将BMSCs与n-HA/PA6复合物植入大鼠颅骨8mm骨缺损处，4、8、16周时，应用组织学、扫描电镜观察植入物与骨组织交界处的成骨修复情况，并与单纯n-HA/PA
2、6植入组修复效果进行比较。结果与代写医学论文，代发国家级期刊。优秀的原创文章，全程高效、保密的合作流程，解决您文章写作难、发表时间长的烦恼。助医代写论文网:服务热线:13296551955咨询QQ:273322232电子邮箱:n-HA/PA6复合培养的BMSCs生长良好，细胞增殖未受影响，ALP染色阳性。BMSCs复合n-HA/PA6植入4周时，有较多新骨长入支架孔穴;8周时，材料和宿主骨融为一体，接近正常骨;16周时，材料和天然骨形成骨性结合。单纯n-HA/PA6组植入4周时，新骨形成较少;8周时，新骨明显增加，但骨钙化程度较低;16周时，2组无明显差异。结论多孔n-HA/PA6支架材料对种
3、子细胞BMSCs的增殖和骨向分化无影响;BMSCs作为种子细胞、n-HA/PA6多孔复合体作为支架材料构建组织工程化骨能够加速界面骨愈合，有效修复颅骨缺损，具有潜在的骨组织工程应用前景。【关键词】骨髓间充质干细胞;纳米羟磷灰石/聚酰胺6;颅骨缺损Reconstructionofcriticalsizedcalvarialdefectsbyporousnano-hydroxyapatite/polyamide6compositewithbonemarrowmesenchymalstemcellsinratGAOYing1，2,LIJi-hua1,LIYu-bao3,ZUOYi3,HUJing1,
4、MAYong-qing1,WANGXue-mei1.(1.StateKeyLaboratoryofOralDiseases,SichuanUniversity,Chengdu610041,China;2.Dept.ofStomatology,TheFirstHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;3.ResearchCenterofNanoBiomaterials,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)AbstractObjectiveToevaluatetheeffectsofthena
5、no-hydroxyapatite/polyamide6(n-HA/PA6)ontheprolifer-ationandosteoblasticdifferentiationofratbonemarrowmesenchymalstemcells(BMSCs),andthefeasibilityofusingbothforconstructingtissueengineeredboneinthecalvariasofratswithcriticalsizeddefects.MethodsThethirdpassageofBMSCswereculturedinosteoblasticmediuma
6、ndseededonthescaffoldsofn-HA/PA6,theproliferationoftheBMSCswastestedbyMTT(3-4,5-dimethylthiazol-2yl-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium-bromide)onscheduleddates,andtheosteoblasticdifferentiationoftheBMSCsweremeasuredbyalkalinephosphatase(ALP)staining.Fur-thermore,thescaffoldswithorwithoutBMSCsinratcalvarial
7、defects,after4weeks,8weeks,and16weekshavebeenimplanted.Histologyandscanningelectronmicroscopewereusedtotestthebonehealinginthedifferentgroups.ResultsTheBMSCsseededonthen-HA/PA6grewwell,theproliferationofcellswasnotaffectedbythescaffold,andthestainingofALPwasalsopositive.At4weekand8weekafterimplantat
8、ion,then-HA/PA6withBMSCsshowedmorenewboneformationonthesurfaceofscaffolds,withabetterosseointegrationofimplantandhostbonewhencomparedwiththegroupofn-HA/PA6withoutBMSCs.However,therewasnosignificantdifferencebetweenthesetwogroupsat16week.ConclusionTheporousn-HA/PA6hasnonegativeeffectsontheproliferati
9、onandosteoblasticdifferentiationofratBMSCs,andusingBMSCsasseedcellsandn-HA/PA6asscaffoldsisagoodchoiceforconstructingtissueengineeredboneduetotheenhancednewboneformationandosseointegration.Keywordsbonemarrowmesenchymalstemcells;nano-hydroxyapatite/polyamide6;calvarialdefects组织工程化骨由种子细胞、生物支架材料2大元素构建而
10、成，其发展克服了自体或同种异体骨移植等传统骨缺损修复方法取材有限、并发症多的弊端，为修复大面积骨缺损提供了全新思路，成为骨缺损治疗新的突破点。种子细胞要求具有来源广泛、易于接种存活、稳定性好等特点，更为重要的是细胞在特定环境下能够实现快速扩增，并具有较强的成骨向分化能力1-2。而生物支架材料则不仅要起到支撑作用，维持原有组织外形，还需起到三维模板作用，为最初的细胞黏附、增殖和分化提供场所，并为随后的受损组织再生提供引导3-4。本研究通过大鼠骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesen-chymalstemcells，BMSCs)与新型多孔纳米羟磷灰石/聚酰胺6(nano-hydroxyap
11、atite/polyamide6，n-HA/PA6)复合体外培养，观察支架材料对BMSCs增殖和骨向分化的影响;并运用此细胞-支架复合体修复SD大鼠颅骨极限缺损，以探讨BMSCs作为种子细胞、n-HA/PA6多孔复合体作为生物支架材料构建组织工程化骨的骨缺损修复效果。1材料和方法1.1实验动物、主要试剂健康成年SD大鼠，体重280350g,雌雄不限，由四川大学华西医学中心实验动物部提供。LG-DMEM培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司，地塞米松、-甘油磷酸钠、维生素C、维生素D3均购自美国Sigma公司。1.2大鼠骨髓BMSCs的体外分离、培养将SD大鼠处死，无菌
12、条件下取其股骨、胫骨，剪去骨骺端，用注射器冲出骨髓，与含10S的LG-DMEM培养基制成细胞悬液，在37、5%CO2的培养箱内贴壁培养，每23d换液。当细胞70%80%融合时，用0.25%胰酶消化，12比例传代。从第3代BMSCs开始，置于骨向诱导液中培养:含10%FBS的LG-DMEM、10nmolL-1地塞米松、10mmolL-1-甘油磷酸钠、0.05mmolL-1左旋抗坏血酸。培养过程中，每天在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况、形态变化，并照相记录。1.3n-HA/PA6多孔支架材料的制备n-HA/PA6由四川大学纳米生物材料研究中心及分析测试中心提供，以NaCl为致孔剂，采用粒子沥滤-
13、相转移法制备。该材料是三维多孔立体结构:孔径50300m，平均孔径180m，大孔壁上存在丰富的微孔，孔径约0.550m，孔隙率67%，且孔间相互贯通(图1)。将制备好的n-HA/PA6切割成直径8mm、厚1mm的小圆片，环氧乙烷消毒备用。图1n-HA/PA6多孔仿生材料SEM40Fig1Micrographofn-HA/PA6SEM401.4矿化诱导的第3代BMSCs与n-HA/PA6多孔仿生材料复合培养直径为8mm的圆形多孔n-HA/PA6薄片在矿化诱导液中浸泡24h后，将矿化诱导10d的第3代BMSCs滴加在材料表面，5%CO2、37孵箱中培养，隔天换液。在复合培养第1、3、5、7、9天时
14、进行MTT比色法检测细胞增殖:每孔加入MTT溶液40L，在37孵箱中孵化4h后，弃上清并加入DMSO150L，在490nm波长下测其光密度值。在复合培养1周时，用胰酶消化细胞，接种于盖玻片上，24h后进行碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)染色:细胞爬片取出，PBS洗涤，多聚甲醛固定15min，ALP孵育液孵育20min，流水冲洗，醋酸溶液浸泡1min，蒸馏水冲洗，甘油明胶封固。将MTT和ALP染色结果与单纯矿化诱导的第3代同期BMSCs检测结果进行比较，以观察n-HA/PA6对BMSCs增殖、分化的影响。1.5种子细胞-支架材料复合体体内植入实验SD大鼠52只，体重2
15、80350g,随机分为3组:1组植入n-HA/PA6与种子细胞复合体(24只)，1组植入n-HA/PA6(24只)，另设4只空白对照组(缺损区不植入任何材料)。将大鼠顶部备皮，10%水合氯醛(3.3mLkg-1)腹腔注射麻醉，无菌条件下头顶皮肤作弧形切口，剥离暴露颅骨，用裂钻制造直径8mm极量骨缺损,根据分组情况植入相应材料，缝合切口。术后第4、8、16周，BMSCs与n-HA/PA6复合组、单纯n-HA/PA6材料组各处死8只动物获取颅骨标本，空白对照组则仅在术后第16周获取样本，分别进行组织学、扫描电镜检测。1.6组织学检查福尔马林固定7d，EDTA脱钙20d，经石蜡包埋后，连续切取厚约5
16、m的组织切片，进行苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察新骨形成情况。对BMSCs与n-HA/PA6复合组、单纯n-HA/PA6材料组第4、8、16周切片采集图像后进行计算机图像分析，统计新生骨组织在骨缺损区所占的面积百分比。1.7扫描电镜检查样本依次经过PBS清洗、戊二醛固定、PBS清洗、锇酸固定、50%100%乙醇梯度脱水、醋酸异戊酯浸泡、临界点干燥、表面喷金，观察并拍照。1.8统计学方法用SPSS10.0软件对数据进行统计学分析。组间比较采用t检验，P0.05认为差异有统计学意义。2结果2.1MTT生长曲线以时间为横坐标，光密度值为纵坐标绘制生长曲线(图2)，结果显示:材料组与对照组之间细胞增殖差异无统计学意义(P0.05)，提示n-HA/PA6对矿化诱导培养的BMSCs的生长和增殖无影响。2.2ALP染色矿化诱导BMSCs复合n-HA/PA6培养1周后，所得细胞爬片A
