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1、酶法评价鸡饲料营养价值的方法学研究进展2010.0227对于畜禽养殖业而言，饲料营养价值评定意义重大，饲料营养价值评定的准确性对满足动物营养需要、为动物提供精确营养、提高养殖效益意义重大，而其中选择合适的评定方法是提高准确性的决定因素。饲料营养价值评定方法主要包括化学分析法、动物消化代谢试验、体外酶法等。化学分析法快速、简便，重复性高，但所测定的结果不足以准确反映饲料营养物质在动物体内的利用率；动物消化代谢试验法结果与动物实际情况接近，符合程度高，但耗时、费力，很难对饲料样品进行快速分析；应用仿生学原理建立的酶法由于吸收了前两种方法优点 (Uden，1992)1，重复性高、速度快、结果准确，因
2、此得到越来越多研究者重视。鸡的基础代谢旺盛，生长周期短，生产力高，必需供给高营养水平的日粮以保证维持和生产需要，所以研究鸡用饲料原料营养价值评定方法意义重大。1 酶法的分类酶法的定义为根据动物体内酶的性质、种类、酶的作用条件（如温度、pH 值、水分等）、胃肠道的蠕动及营养物质的吸收等条件设计生物反应器，进行体外模拟饲料营养物质消化吸收过程的试验方法。酶评定饲料营养价值的方法分为两类。1.1 单酶评定法该方法是主要利用胃蛋白酶在体外进行模拟消化评定饲料营养价值的一种方法，将饲料在酸性（HCl）液体环境中，加入一定活性的胃蛋白酶，在恒温条件下模拟胃消化过程进行反应。此法只适合对饲料中蛋白质一种养分
3、的营养价值和体内消化率进行评价和预测。酶法评价鸡饲料营养价值的方法学研究进展河北农业大学动物科技学院 / 梅学文 陈宝江 许 晴中国农业科学院饲料研究所 / 于会民2010.02272010.0228Pedersen(1983)2建立了一套保持 pH 值恒定不变单酶法预测蛋白质体内消化率的操作程序，并利用该方法分别预测了 31 种植物性蛋白质饲料和 11 种动物性蛋白质饲料的体内消化率，相关性分别为 r=0.85和 0.92。研究表明，在一定范围内，通过测定蛋白质水解程度来预测饲料蛋白质体内消化率是可信的。利用单酶法评定蛋白质饲料时，饲料品质易受饲料粒度和胃蛋白酶剂量等因素的影响，且胃蛋白酶活
4、性高低直接对该方法的可靠性产生影响。1.2 多酶评定法饲料养分在动物消化道内的消化过程，不是由某种单一消化酶独立完成，因此必须对动物消化道内的各种环境条件进行有效模拟，所预测的结果才能与体内情况更为接近。随着对畜禽消化生理的深入研究，酶消化模拟技术由过去的单一酶法发展为现在的多酶法，多酶法不但对胃消化过程进行模拟，而且还对小肠消化以及大肠消化等过程进行模拟。不仅增加了酶的数量还增加了消化产物的分离技术。多酶法根据模拟消化部位的不同又分为两步酶解法和三步酶解法。两步酶解法即模拟胃 - 小肠两部分的消化，先用胃蛋白酶进行消化，然后用肠液或胰酶进行消化，消化结束后利用离心或过滤的方法将已消化养分和未
5、消化养分进行分离 (Buchmann 等，1979)3，此方法分离出来的蛋白质消化产物分子量通常偏大或偏小(Gauthier,1982)4。为了克服消化产物累积对酶促反应的抑制作用，Cave(1988)5利用半透膜去除消化产物，发现去除消化产物可以提高体内与体外养分消化率的相关性，Maurn(1955)6建立了连续透析法，将小肠消化过程放在透析袋内进行，并将透析袋浸泡在 pH 呈中性的缓冲液中，使消化产物不断从透析袋内透析出来进入缓冲液。该方法明显降低了消化产物积累对水解反应的抑制作用，提高了饲料养分酶解消化率。Drake（1991)7对透析袋截流分子量的大小及透析时间等对日粮营养酶解消化率的
6、影响作了研究。研究表明：透析袋的截留分子量是影响酶解消化率的主要因素。三步酶解法，即胃消化、小肠消化、大肠消化，该方法在两步酶解法的基础上增加了瘤胃液或碳水化合物酶。Boisen 和 Femandez(1997)8研究表明：三步酶解法可以用来评定单胃动物日粮的消化能。2 酶法建立的理论依据营养物质在鸡消化道内主要经过物理降解和化学降解，微生物在鸡饲料营养物质的消化中不起直接作用，它主要是通过改变肠道形态来提高营养物质的消化 ( 呙于明，2004)9，而酶的降解占化学降解的主导地位。不同品种鸡对营养物质消化率不同，如固始鸡与蛋鸡、肉鸡对日粮粗蛋白质表观利用率相似，测定其消化道胰蛋白酶活性，发现活
7、性相近；粗脂肪表观利用率则由于胰腺和食糜中脂肪酶活性差异较大而相差显著10；袁建敏 (2001)11等比较肉仔鸡与蛋公鸡蛋白消化酶活性和饲料氨基酸消化率后，证明蛋白消化酶的高低与饲料氨基酸消化率强相关。同一动物对某一营养成分在消化道不同部位的消化率不同，这主要与消化道不同部位的酶活及酶的种类相关，如大部分淀粉在十二直肠前消化12。年龄不同，鸡对饲料营养物质的消化吸收不同，也与其消化道内酶的发育有关，研究表明 , 肉鸡出生时对动物脂肪的消化率很差，随日龄增长对脂肪的消化能力逐渐增加，这主要是由于胰腺分泌的脂肪酶随日龄增加活性增强13。酶法即根据鸡日料营养物质的消化主要是酶的消化这一特性建立的。3
8、 酶法研究的发展历程酶的来源及种类是影响酶法估测鸡日粮营养物质消化率与体内消化率相关性的关键因素，所以根据所应用酶的来源及种类等可将酶法的发展历程分为以下三个阶段。第一阶段：利用胃蛋白酶 - 猪小肠液中酶评定鸡日粮营养价值。Sakamoto 等(1980)14利用胃蛋白酶 - 猪小肠液测定了 4种鸡饲料干物质和粗蛋白质的消化率，发现与鸡体内消化代谢试验结果存在显著相关；卢福庄等 (1986)15、杜荣等 (1990)16用胃蛋白酶 - 猪小肠液冻干粉估测鸡饲料代谢能值，亦均取得了较好的结果。这说明利用猪的消化酶谱来模拟机体内消化过程是可行的。虽然利用猪体外消化模拟操作方法和采用猪的内源消化酶能
9、够在一定程度上用来估测鸡体内养分消化率，但还远远不能完全替代鸡的消化参数和酶谱。第二阶段：利用胃蛋白酶 - 胰酶两步法评定鸡日粮营养价值。Bedford 等 (1993)17以猪胃蛋白酶和胰酶为消化酶源，在与鸡消化道内 pH 接近的条件下，通过对不同的2010.0229胃蛋白酶和胰酶水平以及消化时间对食糜粘性的影响，确立一套适合于鸡的酶法评定饲料营养物质消化率的操作程序。在此基础上，Zyla 等 (1995)18以火鸡为试验动物对该方法进行了改进，实际测定了火鸡嗦囊、胃和小肠内食糜的 pH 作为酶法模拟中的 pH 参数，不仅对胃和小肠的消化过程进行了模拟，还模拟了鸡的嗦囊。同时，还将透析法应用
10、于该方法中，消除消化产物对酶促反应的抑制作用，该方法也是目前鸡体外消化模拟方法中较为成熟的一种。荷兰学者Larsson(1997) 等19对 Zyla 等的操作方法进行改进，使用的胃肠道动态模型，包括胃、十二指肠、空肠、回肠四个连续模拟室，并通过计算机来调控人工小肠液的分泌及消化环境的调节，使其结果更接近鸡消化代谢实验实际结果。第三阶段：利用胃蛋白酶 - 胰酶 - 胆汁提取物评定鸡日粮营养价值。张铁鹰 (2002)20在 Zyla（1995）的基础上以肉仔鸡为试验动物，实际测定了肉仔鸡各消化道内食糜的酶活、含水量、胆汁酸含量和 pH 作为体外消化的参数，建立了一套肉仔鸡酶法评定日粮营养价值的模
11、拟程序，此方法消除了酶法评定过程中胆汁对消化率的影响，较为成功的评定了肉鸡日粮中粗蛋白质、淀粉的消化率及植酸酶的作用效果。4 研究中存在的问题营养物质体内的消化吸收是一个动态的连续过程，在受到各种刺激后，由神经系统和激素来进行精确调控，完全模拟这个复杂的过程是不可能的。酶法是根据仿生学原理而建立的一整套体外测定方法，它与鸡体内的营养物质消化代谢实际过程相比还存在很多不足。4.1 胃蛋白酶 - 小肠液法主要存在问题肠液的制取复杂，且工作量大；肠液中酶活受动物个体、饲养水平、采集部位及年龄等因素的影响，活性高低变化较大。AlexMaiorka 等 (2004)21报道，鸡消化道内脂肪酶的酶活水平受
12、日粮中能量水平的影响；猪肠液中酶的活性与鸡的不同，包承玉等 (1993)22报道猪小肠液中的胰蛋白酶和糜蛋白酶活性比鸡十二指肠及后段肠液中对应的活性低很多。Valdes 和 Leeson(1992)23用胃蛋白酶猪胰液素两步酶水解法测定 71 只成年公鸡日粮的体外消化能值，得出了胰液素中酶的活性及组成、酶水解条件参数是制约此方法准确性的主要限制因素；鸡个体较小，手术安装瘘管不便，肠液的制备受阻。4.2 胃蛋白酶和肠道消化酶法主要存在的问题酶适宜添加量的确定，酶活受日粮类型和鸡的年龄等因素的影响，张铁鹰 (2005)24等研究表明肉鸡空肠内容物中消化酶随日龄增加而增加，达到峰值后逐渐降低，但仍比
13、峰值前高，并逐渐趋于稳定。Noy 等 (1995)25报道，与 4 日龄相比，21 日龄仔鸡十二指肠中淀粉酶、胰蛋白酶、脂肪酶净分泌活性分别增加了 100、50、20 倍。消化道内2010.02292010.0230参考文献1 Uden P.The influence of leaf and stem particle size in vitro and of sample size in sacco on neutral detergent fibrefermentation kinetics.Animal Feed Science Technology.1992,37:85.2 Peder
14、sen B.,Eggum B.O.Prediction of protein digestibility by an in vitro enzymatic pH stat procedureJ.Zeitschrift furtierphysiologie,tierenahrung and fttermittelkunde.1983,49:265 277.3 Buchmann N. B.In vitro digestibility of protein from barley and other cereals. Journal of the science of food andagriculture,1979,30:583 589.4 Gauthier S.F.Assessment of protein digestibility by in vitro enzymatic hydro1ysis with simultaneous dialysis.Journal ofNutrition. 1982,112:1718 1725.5 Cave N A.Bioavailability of amino acids in plant feedstuffs determined by in vitro digestion，chick growth assay
