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1、实验动物与药理学，毒理学研究学术交流会 模式生物斑马鱼在药物安全性评价中的应用 张廷芬夏静彭双清 军事医学科学院疾病预防控制所毒理学评价研究中心，北京1 0 0 0 7 1 上世纪七、八十年代，世界上少数几个实验室发现，斑马鱼可用作动物实验模型。诺贝尔奖获得者德国学者 C h r i s t i a n eN Q s s l e i n - V o l h a r d 与美国学者W o l f g a n gD r i e v e r 和M a r cF i s h m a n 利用斑马鱼首次成功地在一种脊椎动物身上 进行了大规模的基因筛选实验，这一研究工作促使斑马鱼作为人类发育与疾病的动物模
2、型以前所未有的速度兴起， 并引起生物技术与制药业的关注。2 0 0 5 年，H i l l 等进行的不完全统计数据显示，在2 0 世纪9 0 年代初，每年发表的 关于斑马鱼的文献不足1 0 0 篇，到世纪之交相关文献迅速上升到每年平均1 0 0 0 篇，2 0 0 5 年高达年平均3 5 0 0 篇。目 前，斑马鱼已成为国际上一种广受追捧的重要的模式生物。在随后的基因组学研究中科学家发现斑马鱼基因与人类 基因的相似度高达8 7 ，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下可能也适用于人体，因此国内外 药物学家对此高度关注，并思索着是否能将其应用到药物安全性评价。至今，斑马鱼在药物安全性
3、评价中已有了较 广泛的应用，应用范围从一般毒性评价到发育毒性、心脏毒性、肝脏毒性、神经毒性的评价，甚至到耳毒性、软骨 毒性、胃肠毒性的评价。 1 斑马鱼的生物学特点 斑马鱼( z e b r a f i s h ) 起源于印度，为小型的热带鱼类，成体长3 4 锄，孵出后约3 4 个月可达性成熟。5 个月达体成熟繁殖周期短，一般在7 天左右，一年四季都可产卵，每次可产2 0 0 3 0 0 枚不等的鱼卵。鱼卵体外受 精，体外发育，胚胎发育同步，速度快，且透明。斑马鱼的卵径为l 一1 5m m ，幼鱼长1 4m i l l ，其胚胎和出膜后7 天的幼鱼均靠卵黄提供营养，氧气通过膜或皮肤扩散进入体内
4、。斑马鱼对生存的水体环境要求不高，水温在2 5 3 l 之间均可，在2 8 5 最佳，p H 值在6 8 7 8 ，硬度在6 8 。 与低等模式动物果蝇和线虫相比，它与人类的亲缘关系更近；与较高等的脊椎动物大小鼠、灵长类相比，它饲 养成本低，给药方式简单且用量小，同时由于斑马鱼胚胎体外发育且透明，可直接活体观察；胚胎和刚出身的幼鱼 体态娇小可置于9 6 孔板单孔内进行同步试验，并有望实现自动化。这些特点铸就了斑马鱼目前的地位，虽然同时也 存在一些扩大应用的瓶颈，但是生物学家们提出并实践了一些破解方法，例如斑马鱼无法长时间脱离水环境，很多 操作因此受限，可以通过口腔持续灌流来克服；水体给药的方式
5、在实验操作中虽然简便易行，但是给药的实际量会 引起争议，尤其是受精3 天后幼鱼吞咽系统发育完全以后，这可以通过腹腔或血管注射给药来克服，技术要求高。 2 斑马鱼在药物临床前安全性评价中的应用 2 1 一般毒性评价 在上个世纪7 0 年代，国外已经开始应用斑马鱼进行重金属和有机物的急性毒性研究，1 9 8 4 年斑马鱼被经济合作 发展组织( O E C D ) 的指导手册列为实验的标准鱼类，用于化合物的急性毒性检测。在化合物的一般毒性评价可在胚 胎、幼鱼、成鱼的各个阶段进行，相应的观察指标略有不同。在胚胎期，在化合物的作用下可观察终点有卵凝结、 体节形成、尾部延展、心跳、色素沉着、孵化率、畸形率
6、等。幼鱼和成鱼主要是统计L C 5 。、死亡率等。E i m o n 等致 力于研究一种经济的、高通量的、在体的急性毒性实验的方法，通过自动化测量荧光转基因斑马鱼胚胎的荧光量换 算成胚胎体长来评价急性毒性。检测了3 7 种化合物，发现在啮齿类身上L D ；o 小的化合物更易引起斑马鱼胚胎的死 亡和体长的缩短，体长的变化与啮齿类的L D 5 0 能较好对应。这个过程是直接将胚胎放置于9 6 孔板，自动化地检测 荧光的量，省时省力，经济可靠。 2 2 发育毒性评价 最开始斑马鱼作为模式生物应用是在遗传发育学领域，生物学家们发现很多重金属、有机物、环境毒物都具有 实验动物与药理学，毒理学研究学术交流
7、会 发育毒性，并且收集了相应的毒理学终点，与其它系统或靶器官毒性的评价相比，数据较多，方法也较为成熟，所 以在向药物评价领域扩展时发育毒性的评价显得得心应手。在胚胎发育和幼鱼发育过程中，很多器官系统的形成过 程对药物的介入是相当敏感的，比如脑、心血管、肝脏、软骨、脊索、胰腺、肠道、肾脏，极易导致畸形的产生， 是评价药物致畸性的有效模型之一。以血管生成为例，血管生成的模式比较简单，主要出现在头部和躯干部体节间， 体节间的血管最初由背部的动脉出芽形成于相邻体节之间，通过活体染色或原位杂交都可以清晰呈现。P a m g 等1 2 J 在9 6 孔板上用药物处理胚胎，通过血管内源性碱性磷酸酶染色来显示
8、血管，进而评价药物对血管生成的作用。 2 3 心血管毒性评价 新药是否会导致心脏Q T 间期延长是药物研发过程中必须考虑的一个重要大问题，很多药物因此被迫退出市场。 心脏Q T 间期延长的结果表现为尖端扭转性室性心动过速，这是一种严重的经常致命性的心律失常。药物导致的心脏 Q T 间期延长是h E R G 钾通道阻断的结果，斑马鱼也存在非常类似的基因z E R G 。许多在人体上引起Q T 间期延长的 药物也能引起斑马鱼的心动过缓和心律失常。当药物浓度更高时则可引起更严重的不规则心律异常，这些影响都是 特异的、可复制的、迅速的。除此以外，化合物还能引起红细胞的堆积、心包水肿。心脏是斑马鱼第一个
9、发育起来 并发挥作用的器官，也是很多化合物的首要作用靶点。由于胚胎和幼鱼的透明性，无需借助遥测或其他技术就可以 实时观察心跳、心脏的收缩性、血液循环，非常的便利。后来研究发现在人体可引起心肌病、心律失常、负性肌力 效应、Q T 延长的药物米托蒽醌、特非那定、氯米帕明可引起斑马鱼心动过缓、动脉比例失调、收缩性降低、循环减 缓。这些结果表明斑马鱼在心脏毒性评价中应用也是可行的。斑马鱼胚胎早期发育时血管生成的模式和出现的部位 比较简单，这些与生俱来的结构特点使斑马鱼胚胎成为一种理想的评价抗血管生成药物的模式生物。C r o s s 等研究发 现血管荧光标记的转基因斑马鱼可用来快速评价抗血管生成药物，
10、认为其有潜力成为一种高通量评价模型【l 】。一些抗 血管生成药物如S U 5 4 1 6 、S U 6 6 6 8 、T N P 4 7 0 作用于斑马鱼的效果与在哺乳动物中相近，证实了利用斑马鱼初步评价 抗血管生成药物的有效性【2 ，引。 2 4 肝脏毒性评价 药物引起的肝损伤是制药业一个主要的毒理学问题。传统的评价肝毒性主要是在啮齿类和灵长类动物中进行， 包括血清酶检测，肝脏排泄功能检测、肝化学成分改变的检测和组织病理学检测。目前，应用斑马鱼进行的肝脏毒 性评价终点主要有血清酶、肝细胞凋亡、细胞色素P 4 5 0 和组织病理学变化。尤其是代谢酶受到广泛关注，P a m g 研 究组发现在化
11、合物作用下细胞色素P 4 5 0 ( C Y P 3 A 4 和C Y P 2 D 6 ) 所产生的效应与在人体观察的效应基本一致。 2 5 神经毒性评价 传统的神经毒性评价方法有病理组织学、电生理学、行为学等，这些方法都费时费力。斑马鱼胚胎在2 4 h p f 原代 神经元细胞开始分化，4 8 h p f 脑室形成，在6 d p f 所有的神经系统形成，斑马鱼可在短时间呈现整个神经系统，可作 为一个有机载体，建立一个快速的、有效的评价药物神经毒性的平台。P a m g 等发现一些在人体引起神经毒性的化合 物在斑马鱼身上可以引起相似的毒性作用。例如，酒精引起视神经和运动神经缺陷，维甲酸神经元氧
12、化和多巴胺神 经元丢失，新霉素、紫杉醇、维甲酸引起神经元凋亡。通过免疫荧光、全胚胎原位杂交、特罗兰染色等方法来评价 化合物或药物对视神经、运动神经元、多巴胺能神经元、髓鞘的作用。P a r n g 等将具有神经保护作用的1 4 种化合物 用在于斑马鱼身上。这些物质对氧化反应引起的神经毒性表现出显著的保护效果，这是一种特殊的神经毒性评价 4 1 。 还可以通过红外检测斑马鱼的运动轨迹，通过软件分析行为来评价其神经毒性。 2 6 肾毒性评价 斑马鱼的原肾由一对肾单位、两个肾小球和前肾小管组成，较为简单。庆大霉素可引起哺乳动物肾中毒，其表 型在斑马鱼原肾上也可看到，既肾小球滤过率降低。尽管二者结构的
13、复杂程度不一样，但是在肾损伤表型方面却是 保守的。所以以斑马鱼为肾毒性评价载体，能为药物在临床上的应用提供重要的参考价值。 2 7 胃肠毒性评价 斑马鱼的胃肠系统和人体胃肠系统有着千差万别，斑马鱼没有胃，肠道直接开始于咽部下的- - d 段食道之后。 在发育的早期肠道就开始蠕动，在未喂食时就自发的游走性蠕动，由于幼鱼是透明的，这些蠕动清晰可见。将1 0 种 化合物作用于7 d p f 的斑马鱼幼鱼，出现了与期望中的胃肠蠕动加快，而加入平滑肌迟缓剂、异丙肾上腺素、氯丙嗪 时，可看见肠腔扩展。只需要简单的统计蠕动次数即可进行评价。 2 8 视觉毒性评价 目前临床_ I z F , 有多种系统药物损
14、坏视觉通路或视网膜而出现视觉下降，比如双磷酸盐类、抗癫痫剂、肺结核治 疗药物等。斑马鱼有着与人类相似的锥形视网膜，有色彩视觉，这点超越了喜好夜间活动的啮齿类模式生物。同时， 斑马鱼胚胎期视觉系统发育迅速，幼鱼就展示了视觉介导的行为，故可用于评价化合物对视觉的影响。常用的方法 有光动反应，当视力受损时，眼扫视的次数会减少；视动反应是一种高通量的方法，因为运动神经元受损，幼鱼会 实验动物与药理学毒理学研究学术交流会 出现运动缓慢，使固定流通区域幼鱼数量减少。A l d e r t o n 等用视动反应的方法检测了2 7 种化合物，与体内、体外及 临床数据相比，其预测性达到了7 0 。 2 9 耳毒
15、性评价 斑马鱼侧线上的神经丘在结构和功能上就相当于人内耳的毛细胞。神经丘在侧线上从头至尾排列，胚胎时期在 光镜下清楚可见，有助于药物作用下，观察其形态和功能变化。在人类身上具有的耳毒性的药物庆大霉素、顺铂、 奎宁、新霉素可导致斑马鱼神经丘的丢失1 5 】。很多药物引起的耳毒性最终可导致感觉毛细胞死亡，引起失聪和前庭病。 让人遗憾的是许多治疗致命性疾病的药物都具有耳毒性，如治疗癌症的化疗药顺铂，治疗细菌感染的氨基葡糖苷类 抗生素。所以，迫切需要一个能在众多有效药物中间筛选出最小耳毒性药物的评价体系。同时，斑马鱼还可用于耳 保护性化合物的评价。我们知道抗氧化剂、抗凋亡因子、神经营养因子可以防止或减
16、慢毛细胞的丢失，因而我们需 要一个简便、快速的工具来评价有这样作用的化合物。在斑马鱼身上通过D A S P E I 活体染色可直接观察神经丘的数 量变化。 2 1 0 软骨毒性评价 斑马鱼的骨头与人类的相似，颅面骨骼都有膜内和软骨内成骨。斑马鱼也有成骨细胞核和骨细胞，并布满血管， 受神经支配。F l e m i n g 等于9 6 孔板用化合物处理5 一l O d p f 的幼鱼，然后进行茜素红染色以便定量被矿化的软骨。再用 泼尼松龙处理幼鱼，矿化可减少5 0 。这样敏感的变化为斑马鱼在软骨毒性评价中的应用提供了保证。 3展望 斑马鱼是毒性评价独一无二的模型，被用于环境毒性评价已经长达l O 多年，并且O E C D 已建立相关的操作规程。 相信在以上涉及研究领域的展开以及后期研究工作深入的基础上，加上斑马鱼自身的优势，它在药物安全性评价中 的应用也将走向成熟化、进一步规范化。 参考文献 1 C r o s s ，L M ，c ta 1 ，R a p i da n a l y s i s a n g i o
