倒置相差显微镜及荧光显微镜原理、使用与注意事项

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1、倒置相差显微镜及荧光显微镜的使用倒置相差显微镜及荧光显微镜的使用 XXX,YYY,ZZZXXX,YYY,ZZZXXX,YYY,ZZZXXX,YYY,ZZZ (版权所有，仅限个人) 1 1 1 1 倒置相差显微镜倒置相差显微镜倒置相差显微镜倒置相差显微镜 倒置相差显微镜，是将相差显微镜和倒置显微镜相结合的产物，倒置相差显微镜既具有倒置显 微镜的倒置观察方式，同时又具有与相差显微镜相一致的成像原理。 因此，研究倒置相差显微镜的工作原理就需分别研究倒置显微镜和相差显微镜的工作原理。 1.11.11.11.1 倒置显微镜的工作原理：倒置显微镜的工作原理： 倒置显微镜组成和普通显微镜一样，主要包括三部分

2、：机械部分、照明部分、光学部分。其中 与普通显微镜有明显区别的是：物镜与照明聚光系统的相对位置。相比于普通显微镜，倒置显微镜 的物镜与照明聚光系统以载物台为轴颠倒位置，物镜在载物台之下，照明系统在在载物台之上。这 样的构造使得照明聚光系统与载物台的有效距离可以显著扩大，便于放置培养皿、细胞培养瓶等较 厚的待观察器具，而同时物镜与材料之间的工作距离不必很大。 图 1.1 倒置显微镜 由于倒置显微镜观察的材料一般都是培养的细胞，透明性大，结构对比不明显，故倒置显微镜 常配备相差物镜，实际上也就构成了倒置相差显微镜（图 1.1） 。 1.21.21.21.2 相差显微镜的工作原理：相差显微镜的工作原

3、理： 1.2.11.2.11.2.11.2.1 光学知识光学知识 镜检时，视场中的样品只有在其透射光的波长（颜色）和振幅（亮度）与周围介质有明显变化 时， 才能被眼睛所分辨。 照明光线通过无色透明的物体时， 透射光的波长和振幅都不发生明显改变， 尤其是振幅，几乎无变化。所以用普通光学显微镜观察时，难以辨清这样物体的结构，必须借助于 固定和染色等理化方法，使样品和背景的透射光在波长或振幅上发生变化，即在颜色和亮度上有所 差异，以供识别。 一束光线在透过折射率 n 不同的透明介质后，产生的衍射光和透过的直射光的波长没有明显变 化，只是衍射光的振幅稍小于直射光，这也是透明不均质物质产生些许明暗变化的

4、原因，但这一点 变化很小，并不能有效分辨。变化明显的是衍射光相对透射光在相位上有 1/4的滞后，虽然人眼 不能分辨相位的差别，但可以分辨振幅和波长的变化。相差显微镜就是利用这一点，将相位的差别 转变成振幅的变化，也就是将本来均为透明但折射率不同的各个结构显现出明暗差距，从而可以被 清楚地分辨。 可见光光线通过介质水或其他小分子匀质物质时，由于介质分子远小于可见光波长，故而光的 衍射现象并不明显，可以说透射光是直射光。但当可将光透过细胞结构或其他粒径与入射光波长相 近的物质结构时，就会产生明显的衍射现象，透射光转化为衍射光。也就是说，细胞等常见观察物 的结构大小刚好可以使可将光产生衍射现象。相差

5、显微镜就是利用这一点。光波通过小颗粒的物体 后产生直射光和衍射光，衍射光的光波振幅小，相位滞后。在光学系统中，这种直射光和衍射光相 遇或光的叠加，振幅发生变化，光线或明或暗，就是光的干涉现象。 1.2.21.2.21.2.21.2.2 相差显微镜结构相差显微镜结构 相差显微镜不同于普通光学显微镜，在装置上有四种必不可缺的部件：相差物镜（内有相板）、 具有环状光阑的转盘聚光器、合轴调中望远镜和绿色的滤色镜。 1.2.2.11.2.2.11.2.2.11.2.2.1 相差物镜（相差物镜（phasephasephasephase contrastcontrastcontrastcontrast ob

6、jectiveobjectiveobjectiveobjective） 相差物镜与普通物镜的主要区别在于具有相板结构（图1.2） ，相板（phaseplate）是由光学玻璃 制成的，利用光的衍射和干涉现象，将直射光和衍射光的相位差转变为振幅差。 图1.2 相差物镜（示相板） 在圆形相板的平面上，有一圈与周围（里外）相板厚度不同的或凸凹的圆环（图1.3） 。相板分 两部分： （1）共轭面（conjugate area） ：通常为环状，是通过直射光的部分。其环是凸起的，也可能是 凹陷的。 （2）补偿面（complemetary area）：共轭面内外两侧部分，是通过衍射光的部分。 在相板的共轭面或

7、补偿面上，涂有改变光波相位或吸收光线的物质，通常为氟化镁。当光线通 过时，使光波的相位或振幅改变，从而达到不同的目的与观察效果。 图1.3 相板的种类及构造 左上：吸收直射光的明反差相板平面和剖面图； 左下：吸收直射光的暗反差相板剖面图； 右上：吸收衍射光的明 反差相板平面和剖面图； 右下：吸收衍射光的暗反差相板剖面图； 黑色：吸收光线层； 浅色：推迟相位层； 白 色：玻璃。 相板的种类比较多，对光的吸收率高低不同，所以产生不同的反差效果，从反差上大致可分下 列两类（图1.4）： （1）明反差（bright contrast）或负反差（negative contrast）：是指在相差显微镜的视

8、场中， 物 像亮度大于背景亮度的现象。在被检物体的折射率大于周围介质时，直射光被相板的共轭面（因为 在共轭面上涂有改变相位和吸收光线的物质）推迟1/4波长，同时吸收80%90%，振幅变小，致使 仅由直射光照射的背景变暗。通过补偿面的衍射没有变化，由于直射光推迟1/4波长，两者（直射光 与衍射光）有完全相同的相位，合成波P等于直射光S与衍射光D之合，即P=S+D，故振幅加大。所 以被检物体比只有直射光照射的背景亮得多。 （2）暗反差（dark contrast）或正反差（positive contrast）：是指在相差显微镜的视场中，背景 亮度大于物像亮度的现象。与明反差相反，把通过补偿面（因为

9、在相板的补偿面上涂有改变光波相 位的物质）的衍射光推迟1/4波长，使衍射光与直射光的相位相差1/2波长，同时，直射光在共轭面 （上涂吸光物质）被部分吸收（可能是为了避免背景过亮影响观察）。由于两者在像点相互干涉的 结果，使合成波（P=S-D）振幅变小，被检物像的影像比背景显著变暗。 图1.4 明反差与暗反差 左：明反差，直射光（S）与衍射光（D）相位相同，两波干涉结果合成波P=S+D，振幅加大； 右：暗反差，直射 光与衍射光相位相差1/2波长，两波干涉结果合成波P=S-D，振幅变小。 由上所述，正是由于相板的存在，相差显微镜才具有其特殊的分辨能力。在相差物镜内的后焦 面上装有种类不同的相板，因

10、而物镜在明暗反差上可区分为两大类，即明反差（B）或负反差（N） 物镜和暗反差（D）或正反差（P）物镜。物镜的反差类别，用英文字母B或N或D或P标志在物镜外 壳上，并兼有高H（High） 、中M（Medium）和低L（Low）等三种不同的反差。有的相差物镜用ph 字样的标示。 同一反差类别的物镜，依放大率的不同，又可分为10、20、40、和100数种，因此， 相关物镜种类颇多，一套可多达20余种。 相差物镜多为消色差物镜或平场消色差物镜（PL） 。 1.2.2.21.2.2.21.2.2.21.2.2.2 转盘聚光器（转盘聚光器（turretturretturretturret condense

11、rcondensercondensercondenser） 位于镜台之下，普通聚光器的所在位置上，由聚光镜和环状光阑（annular diapheragm）构成。 环状光阑位于聚光镜之下，是一种特殊的光阑装置，由大小不同的环状通光孔构成，不同规格的通 光孔环状光阑装配在一个可旋转的转盘上，按需要调转使用（图1.5） 。环状光阑的环宽与直径 各不相同，与不同放大率的相差物镜内的相板相匹配，不可滥用。转盘前端朝向使用者一面有标示 窗（孔） ，转盘上的不同部位标有0、1、2、3和4或0、10、20、40和100字样，通过标示窗显现。 “0” 表示非相差的明视场的普通光阑。1或10、2或20、3或40

12、和4或100，表示与相应放大率的相差物镜 相匹配的不同规格的环状光阑的标志。通过手动转入的标示窗内之数字，表示该数字所代表的环状 光阑已进入光路。 图1.5 转盘聚光器的构造 1.2.2.31.2.2.31.2.2.31.2.2.3 合轴调中望远镜（合轴调中望远镜（centeringcenteringcenteringcentering telescopetelescopetelescopetelescope） 合轴调中望远镜简称CT，又名合轴调中目镜。它是眼透镜，可行升降调节，具有较长的焦距的 一种望远目镜。镜筒较长，其直径与观察目镜相同。它的功用仅作为环状光阑的环孔（亮环）与相 差物镜相板

13、的共轭面环孔（暗环）的调中合轴与调焦之用。相差显微镜使用时，转盘聚光器的环状 光阑与相差目镜必须匹配，且环状光阑的孔环与相差物镜相板共轭面的环孔在光路中要准确合轴， 并完全吻合或重叠。以保证直射光和衍射光各行其路，使成像光线的相位差转变为可见的振幅差。 但是，镜体的光路中前述两环的影像较小，一般目镜难以辨清，不能进行调焦与合轴的操作，所以 必须借助合轴调中望远镜。 1.2.2.41.2.2.41.2.2.41.2.2.4 绿色滤色镜（绿色滤色镜（greengreengreengreen filterfilterfilterfilter） 相差物镜的种类，从色差消除情况来分，多属消色差物镜（ac

14、hromatic objective）或PL物镜。 消色差物镜的最佳清清晰范围的光谱区为510630nm。欲提高相差显微镜的性能最好以波长范围小 的单色光照明，即接物镜最佳清晰范围的波长的光线进行照明。所以，使用相差物镜时，在光路上 加用透射光线波长为500600nm左右的绿色滤色镜，使照明光线中的红光和蓝光被吸收，只透过绿 光，可提高物镜的分辨能力。该滤色镜兼有吸热的作用，以利活体观察。 1.2.2.51.2.2.51.2.2.51.2.2.5 相差显微镜的光路与成像相差显微镜的光路与成像 相并显微镜的照明光束，由转盘聚集器环状光阑的环状孔射入聚光镜，透射载物台上的被检样 品，经样品后，入射

15、光除透射的直线光外，同时产生衍射光。衍射光的振幅较小，相位滞后。直射 光和衍射光进入物镜，前者由环状的共轭面、后者由较大的补偿面透过相板，前后相互干涉造像。 样品的影像由直射光（S）和衍射光（D）经干涉后的合成波（P）造成，即P=SD；背景仅由直射 光形成。由于直射光和衍射光两种光波的相位差异不同造成不同的反差效果，或明反差或暗反差不 等视所用物镜的相板类别而定。成像光束由物镜射入目镜，在目镜的视场光阑处再次放大，并由出 射光瞳射出目镜。（图1.6） 图 1.6 相差显微镜光路图 根据上述原理和结构所制成的显微镜便是相差显微镜。 1.2.31.2.31.2.31.2.3 相差显微镜的使用相差显

16、微镜的使用 1.2.3.11.2.3.11.2.3.11.2.3.1 相差物镜的调换安装相差物镜的调换安装 从物镜转换器上拆下普通物镜，旋入相差物镜，与普通目镜配套使用。 1.2.3.21.2.3.21.2.3.21.2.3.2 转盘聚光器的调换安装转盘聚光器的调换安装 旋转聚光器升降螺旋，把普通明视场聚光器至最低位，旋松固紧螺丝，卸下聚光器。把转盘聚 光器安放到相应位置上，旋紧固紧螺丝，转动聚光器升降螺旋，使聚光器升至最高位置。转盘聚光 器的标示孔，朝向操作者。此时，转盘聚光器上面的聚光镜部分，进入光路；下面的环状光阑转盘， 可视需要转动使用，把与物镜匹配的环孔旋入光路，使之处于转盘聚光镜下。 转盘聚光器调换安装后，要进行合轴调中，使聚光器的光轴与显微镜的主光轴合一。其步聚如 下： （1）把转盘聚光器的环状光阑调至“0”位，明视场照明的普通可变光阑进入光路。 （2）旋转聚光器升降螺旋，聚光器升至最高位。 （3）接通照明光源，使视场明亮。 （4）把被检样品放到载物台上，用低倍（4）物镜聚焦。 （5）缩小镜座上的视场光阑开孔，至最小。 （6）从目镜观察，在