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1、南方医科大学硕士学位论文平行板流动腔法评价靶向微泡特异粘附效能的研究姓名：吴爵非申请学位级别：硕士专业：内科学（心血管病）指导教师：刘伊丽;查道刚20080415摘要微泡构建效果。本研究目的在于：、探生物素化脂质超声微泡（，）”的制备方法，同步探讨平行板流动腔法检测制备效果的可行性；、探讨应用生物素一亲和素桥接法制备“携羊抗小鼠单抗超声微泡（，）”，并应用平行板流动腔法体外评价自制特异靶向粘附小鼠的能力；、应用生物素一亲和素桥接法制备出“靶向小鼠一选择素超声微泡（，），利用平行板流动腔模拟生理血流条件以评价其靶向粘附效能，为下一步在体评价血管内皮炎症及指导在体应用的环境范围奠定基础。方法：一、
2、的制备及应用平行板流动腔法评价的制备效果、的制备及理化性质鉴定通过声振法制备出“普通脂质微泡（，）和“表面载有生物素脂质的超声微泡（）。库尔特计数仪检测微泡的粒径分布及浓度，普通光学显微镜下动态观察微泡的稳定性；以大鼠肾脏模型评价及的对比超声（，）显影效果：并用生物素一亲和素桥接法在其表面连接上标记的链亲和素，荧光显微镜镜下观察微泡的荧光情况以确定微泡表面是否带有生物素化脂质。、平行板流动腔法评价的制备效果应用包被不同浓度链亲和素的聚苯乙烯培养皿作为平行板流动腔体外检测微泡粘附稳定性的平台。以包被高浓度链亲和素（）的培养皿观察普通脂质微泡非特异性粘附效果为对照，分别采用链亲和素高浓度包被（肛）
3、、低浓度包被（）及空白培养皿检测粘附稳定性，所有分组均按平行板流动腔实验说明书要求检测个样本；采用解离实验，每倍增剪切应力硕士学位论文（），分别检测各组微泡达半数解离时的剪切应力。二、平行板流动腔体外评价的特异靶向粘附性能、制备表面载有生物素化脂质的超声微泡后，采用生物素一亲和素桥接方法构建，库尔特计数仪检测及显微镜下观察微泡的粒径分布和浓度。、评价显影效果：大鼠只，进行下肢，观察下肢血管成像及肌肉灌注情况。、用平行板流动腔评价特异靶向粘附性能在以不同浓度（、和）小鼠包被培养皿的平行板流动腔中，（）经微量注射泵以固定剪切应力（）通过，显微镜下观察有微泡出现后开始录像，分别检测靶向微泡在不同时间
4、点（、和分钟）结合于平行板流动腔中的数量，并以“包被大量羊抗小鼠封闭（封闭组）和“小鼠包被（空白组）”，评价平行板流动腔法检测的靶向粘附能力。各组样本数均为。三、模拟生理血流条件下靶向一选择素微泡对一选择素的特异粘附效能、利用生物素一亲和素桥接法构建靶向小鼠一选择素超声微泡（），库尔特计数仪检测和显微镜下观察微泡的粒径分布及浓度。、平行板流动腔体外评价靶向粘附效能、结合实验：（）经微量注射泵以剪切应力分别通过以不同浓度“小鼠一选择素段（，）包被（）的平行板流动腔；自显微镜下观察到有微泡出现后开始连续录像，观察每分钟微泡的靶向结合情况；以“包被大量抗小鼠一选择素单抗封闭（封闭组）”和“包被（空白
5、组）为对照；在。包被组还分别分组以、和通过平行板流动腔；、解离实验：平行板流动腔以（、和）包被，流动腔内注入约后静置分钟，先以生理盐摘要水（极低切应力条件下）冲洗掉静止但未结合的微泡，待镜下无游离的微泡后，每逐渐增加剪切应力，直至微泡完全解离。倍物镜在固定的视野下全程录像、拍照。结果：一、的制备及应用平行板流动腔法评价的制备效果、的制备及理化性质鉴定、采用声振法制备的船及在显微镜下观察均为透亮微气泡，库尔特计数仪检测平均直径为比，浓度为，平均直径为，浓度为个！。所有微泡静置过夜后均明显分层，保存天后观察微泡形态及浓度无明显改变、荧光显微镜检查见生物素一亲和素桥接法连接的链亲和素荧光脂质超声微泡
6、，大小均一、结构完整并带有均匀的绿色光环，证实微泡表面成功携带生物素脂质。、经大鼠外周静脉注射及均能获得满意的大鼠肾脏超声显影。、平行板流动腔法评价的制备效果、可稳定结合于链亲和素包被的培养皿上，且其结合稳定性随着链亲和素包被浓度的提高而增加（，）；对于高浓度链亲和素包被组，使半数解离剪切应力为（），当剪切应力达时微泡才完全解离；、在没有包被链亲和素的空白培养皿上，于低切应力条件下即见明显的微泡解离，提示不能稳定结合于空白培养皿上；、在高浓度链亲和素包被的培养皿上，于低切应力条件下即见明显的微泡解离，说明难以稳定结合于高浓度链亲和素包被的培养皿表面。二、平行板流动腔体外评价的靶向粘附效能、应用
7、生物素一亲和素桥接法成功制备，制备出的形状、硕士学位论文大小及浓度与相似；、经大鼠外周静脉注射能获得满意的大鼠下肢血流及肌肉灌注显影效果。、在剪切应力的流体状态下，可与小鼠包被的平行板流动腔靶向结合，而封闭组及空白组在各时间点上均未见明显靶向超声微泡结合（个视野），不同浓度实验组在各时间点上均可见不同程度的微泡结合（个视野），且包被浓度与观察时间之间存在交互作用（，），经重复测量方差分析后并画图显示其结合率随着平行板流动腔上小鼠包被浓度的提高而增加（尸）。三、模拟生理血流条件下靶向一选择素微泡对一选择素的特异粘附效能、库尔特计数仪检测及显微镜下观察显微镜下为透亮微气泡，库尔特计数仪检测显示其平
8、均直径，浓度为个。制备出的形状无明显变化、平均直径为，浓度为个。、靶向微泡的结合、平行板流动腔实验显示与包被的平行板流动腔靶向结合，在血流剪切应力为，经过不同浓度包被的的平行板流动腔，重复测量方差分析显示不同包被浓度与观察时间之间存在交互作用（，），结合率随着平行板流动腔上。包被浓度的提高而增加（，），几乎不能与空白培养皿结合，同样，也难以与被抗小鼠一选择素单克隆抗体封闭掉位点的，。结合。、包被浓度为，给予种剪切应力处理，可见的靶向结合率受剪切应力影响，且不同剪切应力与观察时间之间存在交互作用（，），结合的微泡早期随着剪切应力增大而增加，至剪切应力作用时达最大结合，但随着剪切应力继续增加，微泡
9、结合率下降，不同剪切应力处理组微泡结合率之间比较有显著差异（，）。摘要、靶向微泡的解离每增加一次剪切应力对微泡的冲刷以观察镜下仍结合的微泡，其中包被浓度与剪切应力间存在交互作用（，），并可见在高浓度包被的平行板更能抵抗血流剪切应力（，），在浓度为包被的平行板流动腔中，约的剪切应力方能使结合的半数解离。结论：一、应用声振法制备生物素化脂质微泡成功，此种微泡可通过生物素一亲和素桥作用制备出携带各种靶分子的靶向微泡，为靶向超声分子成像打下基础。二、成功建立应用平行板流动腔检测生物素化脂质微泡对链亲和素的靶向粘附效果的方法学；该方法的建立对于在体外特异性的检测靶向超声微泡对靶分子的粘附效能有重要意义。三、应用生物素一亲和素桥接法构建携羊抗小鼠单抗靶向微泡，并用平行板流动腔证实该微泡对小鼠的特异靶向粘附作用，提示应用该构建方法可以在生物素化脂微泡表面添加抗体。四、应用生物素一亲和素桥接法构建了靶向一选择素的超声微泡成功，并用平行板流动腔体外模拟生理血流条件评价携抗小鼠选择素靶向微泡对小鼠选择素的靶向粘附效能。五、平行板流动腔实验证实靶向微泡的靶向能力受对应靶分子的表达浓度及剪切应力影响，使用该方法验证可以得出靶向微泡在不同剪切应力下的靶向粘附能力，从而指导靶向微泡的在体应用的环境范围。关键词：靶向微泡平行板流动腔分子成像靶向粘附硕士学位论文：，
