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1、在体诱导表皮细胞去分化的初步实验研究蔡飒 付小兵 雷永红 韩冰 郭永峰 孙同柱 王君 李海红（解放军总医院第一附属医院全军创伤修复重点实验室，北京 100037）摘 要： 目的 在体诱导表皮细胞去分化，探索与表皮细胞去分化有关的信号通路。方法 包皮皮片去除皮下组织，用中性蛋白酶分离表皮，型胶原反复粘贴并牵拉表皮去除基底细胞层。处理后表皮片移植于裸鼠全层皮肤下，分别于3，5，7 d取出移植皮片，采用免疫组织化学染色，流式细胞仪检测，Western blot和RT-PCR等方法检测皮片移植前后表型的改变和ERK MAPK通路各信号分子表达的变化情况。结果 去基底细胞层处理的表皮片干细胞标志物CK1
2、9和b1整合素染色阴性；移植后5d，存活皮片CK19和b1整合素染色呈多层分布，而不是正常表皮中的单层分布。流式细胞仪检测结果显示，表皮片移植后CK19阳性细胞和1整合素阳性细胞分别由移植前的0.00%和0.00%增加到7.54%和5.24%，而CK10阳性细胞由99.62%下降为86.56%。Western bloting和PCR检测也证实CK19和b1整合素蛋白水平和mRNA水平表达在移植后明显增强。ERK及上下游信号分子（p- Raf、p-MEK1/2、p-ERK1/2、和c-myc）表达增强。t-MEK1/2和t-ERK1/2移植前后表达无显著差异。结论 处于终末分化阶段的表皮细胞可以
3、向干细胞状态逆转，这个过程可能与ERK MAPK信号通路有关。关键词：去分化；异种移植；表皮细胞；表皮干细胞；胞外信号调节激酶（ERK）中图法分类号：R329The in vivo study of dedifferentiation of epidermal cells CAI Sa，FU Xiao-bing，LEI Yong-hong, HAN Bing，GUO Yong-feng，SUN Tong-zhu，WANG Jun，LI Hai-hong (Wound Healing and Cell Biology Laboratory Burns Institute, The First A
4、ffiliated Hospital of General Hospital of PLA, Trauma Center of Postgraduate Medical College, Beijing 100037, China) 基金项目：国家重点基础研究发展计划（973计划）（2005CB522603）；国家自然科学基金（30500194）Supported by the National Basic Research Program (973 Program)( 2005CB522603) and the Nationgal Natural Science Foundation of
5、China（30500194）作者简介：蔡飒，女，福建省晋江市人，博士，主要从事皮肤创伤修复与再生的研究。电话：（010）66867391，E-mail：cai_通信作者：付小兵，电话：010-66867396。 E-mail: Abstract： Objective to induce dedifferentiation of epidermal cells in vivo and explore the signaling pathway involved in the process. Methods the epidermis of human foreskin was isolate
6、d from dermis by digestion with protease, and the cells in the stratum basale of the epidermis together with stem cells were eliminated by repeated adhesion to collagen type . After being labeled with DAPI, the treated ultrathin epidermal sheets were transplanted under the fresh full-thickness skin
7、wounds measuring about 1 cm in diameter on the back of athymic BALB /c nude mice. The transplanted ultrathin epidermal sheets were harvested from the recipient nude mice at d 3, 5 and 7 after xenotransplantation. Immunohistochemical, Western blot and RT-PCR analyses were used to determine the change
8、s in phenotype and in ERK signaling pathway of the xenografts. Results CK19, b1 integrin, p63 and Oct4 positive cells were found in a single layer in stratum basal of the full-thickness epidermis, but were undetectable in ultrathin epidermal sheets before grafting. Most of the ultrathin epidermal sh
9、eets grew well with soft and ruddy appearance after transplantation and the total survival rate was 86.3%. Immunological examinations showed that a certain number of cells were positive for CK19, b1 integrin, p63 and Oct4 in spinous and granular layers after transplantation and that ERK MAPK pathway
10、 was involved in the reversion process. Conclusion The differentiating epidermal cells could reverse to stem cell-like cells, and the process might be associated with the regulation of ERK MAPK signaling pathway.Key words：Dedifferentiation；Xenotransplantation；Epidermal cells；Epidermal stem cells；Ext
11、racellular signal regulated kinase (ERK)9去分化，即逆行性分化，是指细胞沿着与发育相反的方向从相对高分化的状态转变为低分化的状态，它是发育生物学和形态学领域一个古老而又常新的现象。通常情况下，植物细胞具有全能性，即使是已高度成熟和分化的细胞，也还保持着回复到分裂状态的能力，即具有去分化能力。两栖动物也能依赖去分化-增殖-再分化过程来完成对受损四肢，尾部，脊柱，视网膜等组织的修复1-4。传统观念认为哺乳动物细胞的分化是不可逆转的，故再生能力十分有限。但新近的研究显示人和其他哺乳动物的细胞也存在去分化潜能。在某些因素诱导下，一些终末分化细胞可以去分化为干细胞
12、样细胞，最终产生不同类型的功能细胞修复机体的受损组织。Fu5等发现皮肤溃疡创面经rhEGF治疗后，在表皮基底层与角质层之间的棘细胞与颗粒细胞中出现可能由分化成熟的表皮细胞去分化而来的干细胞岛。这一现象提示表皮细胞具有由终末分化阶段向干细胞状态逆转并参与皮肤创伤修复和再生的潜能。为了进一步证实这一现象的可靠性和其可能的信号机制，本实验通过建立表皮细胞在体去分化模型，检测MAPK信号通路在表皮细胞去分化过程中的作用，探讨影响和调控表皮细胞去分化为表皮干细胞的机制，为进一步开展促进创面功能修复和提高创面修复质量的研究提供基础。1 材料与方法1.1 动物和主要试剂BALB/c裸鼠（中国医学科学院动物所
13、），中性蛋白酶、型胶原、小鼠抗人单克隆抗体CK10、CK19、1整合素和羊抗鼠二抗HRP-IgG（美国Sigma公司），肌动蛋白（美国Santa Cruz公司），化学发光试剂盒（美国Pierce公司），硝酸纤维膜（美国Pall公司），荧光定量PCR试剂盒（美国Promega公司），磷酸化-ERK1/2信号通路试剂盒（美国Cell Signaling Technology公司），角质细胞基础培养基（Epilife，美国Cascade Biologics公司）1.2 表皮细胞去分化模型的建立签署知情同意书后，取手术切除的成人包皮，剪除皮下脂肪组织，并将皮肤切成0.5 cm 0.5 cm的小块，角质
14、细胞基础培养基（Epilife）清洗。将包皮浸泡于含有青霉素和链霉素的中性蛋白酶内，24 h后将表皮与真皮分离，并将表皮的基底层贴附在预先用型胶原包被的培养皿内20 min，之后反复牵拉表皮片，以去除表皮基底层的干细胞，在裸鼠背部切开皮肤全层，切口长约1 cm，游离皮下组织，将去除表皮干细胞的表皮组织片移植入切口处皮下，未直接接触裸鼠表皮，缝合皮肤。将完整表皮片和去除基底层干细胞未进行移植的皮片设为对照。分别于移植后3、5、7 d重新切开切口，取出移植皮片。1.3表皮细胞去分化前后表型的改变1.3.1免疫组织化学检测 全部皮肤组织标本常规固定、脱水、石蜡包埋、4 m连续切片、脱蜡、水化，然后用
15、PowerVixionTM二步法免疫组织化学染色。二步法免疫组化染色步骤：3%过氧化氢室温孵育10 min以阻断辣根过氧化物酶，根据抗体要求对抗原进行热修复，即将组织切片置于热柠檬酸缓冲液中，放入微波炉高火8 min，低火15 min，室温冷却。再用盐酸缓冲液（PBS）清洗3次，每次5 min，以充分洗掉过氧化氢。分别滴加小鼠抗人单克隆第一抗体CK19（1100稀释）和1整合素（150稀释）4 过夜，PBS清洗3次，每次5 min，充分洗掉未结合一抗。滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗，室温作用1 h，PBS清洗3次，每次5 min。阴性对照组不加一抗或二抗。二氨基联苯胺（DAB）染色，
16、阳性细胞着棕色。苏木素复染，脱水透明，中性树脂封片，显微镜下观察，高倍视野下计数阳性细胞，随机选取5个高倍视野。1.3.2 流式细胞学检测 移植前后的去基底层包皮片，用胰蛋白酶消化液于37消化10min30min。再用含10%FBS的培养基中和后，1000rpm离心，10 min。收集细胞沉淀，用PBS洗涤3次，5 min/次。加入1:50稀释的CK10，CK19和1整合素单克隆抗体，4孵育30min；PBS洗涤3次，每次5min；同时用PBS代替一抗作空白对照；加FITC标记的山羊抗小鼠IgG二抗，工作浓度1:50；4避光孵育30min；用PBS洗涤3次，5min/次。最后，样品转入到流式专用试管，上机，检测，每个样本设平行组。1.3.3 Wes
