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1、1 ABI Prism7500型荧光定量PCR仪 用户基本操作培训 美国应用生物系统中国公司美国应用生物系统中国公司 客户服务部客户服务部 2 内容提要 1、仪器简况、仪器简况 2、定量、定量PCR的数学原理的数学原理 3、定量、定量PCR的化学原理的化学原理 4、等位基因鉴定原理、等位基因鉴定原理 5、定量、定量PCR实验实验 6、定量、定量PCR的数据处理的数据处理 7、日常维护、日常维护 8、应用举例、应用举例 仪器简况仪器简况 4 7500功能一览 绝对定量(Absolute Quantification) 自动计算基线、阈值、CT值、浓度、百分比 相对定量(Relative Quan
2、tification) 等位基因分型(Allelic Discrimination) 阴阳性鉴定(Plus/Minus with IPC) 5 7500推荐使用的荧光组合的荧光组合 报告荧光报告荧光(Filter A)FAM 或 SYBRGreen I 报告荧光报告荧光(Filter B)VIC 或 JOE 报告或淬灭荧光报告或淬灭荧光(Filter C)NED或 CY3或TAMRA 参比荧光参比荧光(Filter D)ROX 或 Texas Red 报告荧光报告荧光(Filter E)CY5 定量定量PCR的数学原理的数学原理 7 PCR曲线有两种表达形式 线性图谱半对数图谱 8 典型的PC
3、R分4个阶段 平台期 线性增长期 基线期 指数增长期 9 起点定量与终点定量 ? 起始起始DNA量是样本中本来的量，更有意义； 终点 量是样本中本来的量，更有意义； 终点DNA量经过量经过PCR “加工加工”，不是研究所需要的数据，不是研究所需要的数据 ? 起点定量误差小，终点定量误差大起点定量误差小，终点定量误差大 同一个样品重复96次 终点定量 起点定量 10 什么是CT值 定义：从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数定义：从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数 CT值必须位于指数增长阶段内值必须位于指数增长阶段内 线性图谱 半对数图谱 CT值CT值 CT值与起始DNA浓度的关系 CT值
4、lg 起始DNA浓度 CT = - k lgX0+ b 12 基线?阈值?CT值 基线调整规则 如果CT值 18，不需调整，使用自动分析结果 如果CT值 18，使用自动分析结果，出报告，使用自动分析结果，出报告 3. 如果有如果有CT值值18，根据，根据最小的最小的CT值值-4 修改基线修改基线终点，终点，重新分析数据重新分析数据 30 怎样获得引物探针？ 1. 推荐到上查询现成的 试剂盒，保质期5年 定量试剂盒：定量试剂盒：50万个，针对人类、大鼠、小鼠、万个，针对人类、大鼠、小鼠、 Arabidopsis和果蝇的全部基因和果蝇的全部基因 SNP试剂盒：试剂盒：40万个人类万个人类SNP位点
5、位点 2. 或者提供60-300 bp的序列，AB为用户设计合成 引物和探针 31 定量PCR反应体系 试剂体积终浓度试剂体积终浓度 DNA 5 10-100 ng 2 x Universal Master Mix251 x 20 x 引物探针试剂盒2.5 1 x H2O17.5 Total50 uL 50 C 2 min 95 C 10 min (92 C 15 sec 60 C 1 min) x 40 循环 反应总体积：96孔板25 - 50 uL；384孔板5 - 15 uL 32 金牌Taq酶的好处 ?常温下没有活性，必须经过常温下没有活性，必须经过 95 10min 热启动热启动 ?
6、阻断加样后、阻断加样后、PCR正式开始前的随 机扩增及伴随产生的信号，降低本 底，提高定量的灵敏度 正式开始前的随 机扩增及伴随产生的信号，降低本 底，提高定量的灵敏度 33 UNG酶的好处 ? 有效地防止污染有效地防止污染 ? UNG酶能切断所有含酶能切断所有含dU的双链或单链的双链或单链DNA ? 含含U的的DNA是是PCR产物，其气溶胶造成实验室污染产物，其气溶胶造成实验室污染 U U U U 50, 2min UNG 34 校正荧光的好处 参比荧光ROX 以固定的浓度混合于Universal PCR Master Mix和SYBR Green Mix中 不参与PCR反应，ROX信号强度
7、与试剂体积、荧光激发条件等有关 消除体积误差、管盖厚度误差、光学激发误差等消除体积误差、管盖厚度误差、光学激发误差等 减少孔间差异、批间差异，提高数据重现性和精度减少孔间差异、批间差异，提高数据重现性和精度 报告荧光报告荧光报告荧光报告荧光/ /参比荧光参比荧光参比荧光参比荧光 = = FAMFAM/ /ROXROX或者或者或者或者VICVIC/ /ROXROX Reporter Reference 35 ROX校正的效果 没有没有ROX校正，就做不到定量校正，就做不到定量 ROX校正前校正前ROX校正后校正后 定量定量PCR的数据处理的数据处理 37 绝对定量与相对定量 绝对定量相对定量绝对
8、定量相对定量 600个拷贝个拷贝 比较两个样品 增加了 比较两个样品 增加了10倍倍 绝对定量：绝对标准曲线法 目标：确定样品中目标基因的准确拷贝数目标：确定样品中目标基因的准确拷贝数 20,000 copies 10,000 copies 5,000 copies 2500 copies 1250 copies Unk1 Ct=24.8 Unk1浓度=4000 拷贝 相对定量：相对标准曲线法 目的：比较基因的相对含量，不需要知道拷贝数目的：比较基因的相对含量，不需要知道拷贝数 标准品：由一个标准品梯度稀释而成标准品：由一个标准品梯度稀释而成 Unk1 浓度 = 0.2 a Unk2 浓度 =
9、 0.1 a 相差2倍 a a a 1/8 a Unk1 Ct=24.8 1/16 a Unk2 Ct=25.8 40 相对定量： CT法 依据：平均相对含量 = 2 平均CT 好处：不需要做标准曲线 日常维护日常维护 42 日常维护注意事项 每周维护 归档备份实验数据归档备份实验数据(.sds文件文件) 关闭计算机和仪器的电源开关，然后重新打开关闭计算机和仪器的电源开关，然后重新打开 使用不脱毛的软布擦拭仪器表面使用不脱毛的软布擦拭仪器表面 重 要！切勿使用有机溶剂清洁重 要！切勿使用有机溶剂清洁7500 PCR 仪仪 每月维护 执行背景校正执行背景校正 执行计算机硬盘碎片整理程序执行计算机
10、硬盘碎片整理程序 43 日常维护注意事项 半年维护 执行纯荧光光谱校正执行纯荧光光谱校正 执行目标区执行目标区 (ROI) 校正校正 以下工作根据需要进行 清除样本加热块中的荧光污染清除样本加热块中的荧光污染 更换卤素灯更换卤素灯 更换保险丝更换保险丝 搬动仪器搬动仪器 应用举例应用举例 45 I类应用：实时定量 ?肥胖基因与糖尿病之间的关联性研究 ?心血管疾病相关基因表达量研究 ?溶血性胎儿贫血的早期检测 ?转基因食品(GMO)检测 ?癌基因表达量研究 ?细胞凋亡的研究 ?优生保健筛查 ?病原体检测 ?新药研发 3600 46 II类应用：等位基因鉴定 (终点读板) 基因突变分析基因突变分析
11、 单基因遗传病的诊断，如血友病、地贫等单基因遗传病的诊断，如血友病、地贫等 SNP研究研究 疾病相关基因鉴定，如牛皮癣、哮喘相关基因疾病相关基因鉴定，如牛皮癣、哮喘相关基因SNP鉴定鉴定 SNP检测与临床表现的相关性，如抗高血压药物疗效的 个体差异 检测与临床表现的相关性，如抗高血压药物疗效的 个体差异 药物副反应的预防，如麻醉意外药物副反应的预防，如麻醉意外 物种鉴定、菌株鉴定物种鉴定、菌株鉴定 病毒、细菌、真菌等病毒、细菌、真菌等 用户培训用户培训 用户培训 1. 安装完毕，工程师立即按安装完毕，工程师立即按SOP进行进行基本操作培训基本操作培训 培训合格，每台仪器发2张证书 2. 定期定
12、点举办系列培训班，按专题进行定期定点举办系列培训班，按专题进行应用培训应用培训 日程表每半年更新一次，在上 3. 根据用户需要，到实验室现场进行根据用户需要，到实验室现场进行项目培训项目培训 包括理论和实验，每项3天时间，培训合格发2张证书 需要更多的培训？需要更多的培训？ 1. 日常仪器操作和报修：建议由持有基本操作培训证 书的人员进行，全国服务中心免费电话： 日常仪器操作和报修：建议由持有基本操作培训证 书的人员进行，全国服务中心免费电话： 8008100192 2. 更多更多基本操作培训：基本操作培训：通过服务中心免费电话通过服务中心免费电话 8008100192预约，安排工程师上门预约
13、，安排工程师上门 3. 更多更多应用培训：应用培训：与应用专家预约，参加培训班与应用专家预约，参加培训班 现场实验培训项目 1. DNA定量定量 2. 病原微生物定量病原微生物定量 TaqMan探针法探针法 TaqMan MGB探针法探针法 SYBR Green I染料法染料法 3. SNP与疾病的关联研究与疾病的关联研究 4. 致病基因突变鉴定致病基因突变鉴定 5. 病源微生物鉴定病源微生物鉴定 TaqMan MGB探针法探针法 *实验培训每项实验培训每项3天时间，详见技术服务手册天时间，详见技术服务手册 欢迎联系AB公司 资料查询： 英文原版操作手册、说明书下载 基因定量和 资料查询： 英文原版操作手册、说明书下载 基因定量和SNP引物探针试剂盒查询引物探针试剂盒查询 全国维护中心电话：全国维护中心电话：8008100192 欢迎联系AB公司 资料查询： 英文原版操作手册、说明书下载 基因定量和 资料查询： 英文原版操作手册、说明书下载 基因定量和SNP引物探针试剂盒查询引物探针试剂盒查询 全国维护中心电话：全国维护中心电话：8008100192
