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1、免疫学实验一,外周血单个核细胞的分离,外周血单个核细胞的分离,原理 试剂和仪器 实验步骤 注意事项,原 理,外周血各种血细胞的密度不尽相同,利用淋巴细胞分层液(Ficoll)作密度梯度离心,使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布,从而将各种血细胞加以分离。,原 理,外周血,红细胞,粒细胞,单个核细胞,血小板,淋巴细胞,单核细胞,1.093,1.0301.035,1.0751.090,Ficoll:1.0770.001,(PBMC),1.092,1500rpm, 20 , 30min,PBMC,红细胞粒细胞,Ficoll,稀释外周血,Ficoll,稀释的血浆、血小板,实验步骤,1.采血,稀释 (外
2、周血:稀释液=1:2) 2.在离心管中加入Ficoll,沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血 (Ficoll:稀释血=1:2),实验步骤,3.20,1500r/min,离心30min 4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中,实验步骤,5.加足量稀释液充分洗涤,1800 r/min离心10min ,弃上清 6.重复洗涤一次,1400r/min离心10min,弃上清 7.适量的培养基重悬细胞 ,计数,试剂和仪器,淋巴细胞分层液(Ficoll,低温避光保存),Hanks液,RPMI1640,PBS,小牛血清,华氏管,50ml离心管,2ml(5ml)吸管,水平离心机,注意事项,1.每毫升外周血液大
3、约可获1106单个核细胞 2.Ficoll应适量,外周血应充分稀释 2.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果 3.在Ficoll上加入稀释外周血时,应缓慢加,以免冲散界面 4. 吸取单个核细胞层时,应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染,细胞计数,试剂和仪器 实验步骤 注意事项,试剂和仪器,血球计数板,盖玻片,Hanks液,RPMI1640,2ml(5ml)吸管,华氏管,移液尖,微量移液器,显微镜,实验步骤,1、准备计数板: 2、制备细胞悬液:收集细胞,制成单个细胞悬液 3、加样:用吸管轻轻吹打细胞悬液,取少许细胞悬液,在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液, 4、计数:在显微镜下,用10物镜观察计数板四角大方格中的细胞数,实验步骤,5、计算:将结果代入下式,得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =(4大格细胞数之和/4)104,注意事项,1.取样计数前,应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片,也不要过少或带气泡 3.细胞压中线时,数上不数下,数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 5.镜下计数时,细胞数过少或过多,说明稀释不当,需重新制备细胞悬液、计数,实验要求,华氏管中加入血样后,用记号笔作好标记 实验完毕后,请清洗试管、吸管和计数板,试验报告要求,试验内容 (原理、步骤), 结果 试验注意事项,