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1、北京益康农科技发展有限公司 ECA-YLS02 叶绿素荧光仪- 1 -荧光测量原理调制法叶绿素荧光 调制叶绿素荧光全称 脉冲-振幅-调制（Pulse-Amplitude-Modulation,PAM）叶绿素荧光，我们国内一般简称调制叶绿素荧光。调制叶绿素荧光仪的工作原理：植物吸收的光能只有 3 条去路：光合作用、叶绿素荧光和热。根据能量守恒：1光合作用叶绿素荧光热。可以得出：叶绿素荧光1光合作用热。也就是说，叶绿素荧光产量的下降（淬灭）有可能是由光合作用的增加或热耗散的增加引起的。由光合作用的引起的荧光淬灭称之为光化学淬灭（photochemical quenching, qP）；由热耗散引起
2、的荧光淬灭称之为非光化学淬灭（non-photochemical quenching, qN 或 NPQ）。光化学淬灭反映了植物光合活性的高低；非光化学淬灭反映了植物耗散过剩光能为热的能力，也就是光保护能力。 用于激发荧光的测量光具有一定的调制频率，检测器只记录与测量光同频的荧光，因此调制荧光仪允许测量所有生理状态下的荧光，包括背景光很强时。正是由于调制技术的出现，才使得叶绿素荧光由传统的“黑匣子”（避免环境光）测量走向了野外环境光下测量，由生理学走向了生态学。饱和脉冲法叶绿素荧光：饱和脉冲（Saturation Pulse, SP）可被看作是光化光的一个特例。光化光越强，PS II 释放的电
3、子越多，PQ 处累积的电子越多，光合电子传递被阻越多，荧光产量越高。当光化光达到使光合电子传递完全被阻（不能进行光合作用）的强度时，就称之为饱和脉冲。所谓饱和脉冲技术，就是打开一个持续时间很短（一般小于 1 s）的强光关闭所有的电子门（光合作用被暂时抑制），从而使叶绿素荧光达到最大。常用叶绿素荧光参数：经过充分暗适应后，所有电子传递链均处于开放态，打开测量光得到最小荧光Fo，此时给出一个饱和脉冲，所有的电子门就都将该用于光合作用的能量转化为了荧光和热，此时得到的叶绿素荧光为最大荧光 Fm。根据 Fm 和 Fo 可以计算出 PS II 的最大量子产量 Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm，它反映了植
4、物的潜在最大光合能力。 在光照下光合作用进行时，只有部分电子传递链处于开放态。如果给出一个饱和脉冲，本来处于开放态的电子传递链将该用于光合作用的能量转化为了叶绿素荧光和热，此时得到的叶绿素荧光为 Fm。根据 Fm和 F 可以求出在当前的光照状态下 PS II 的实际量子产量 Yield=PSII=F/Fm=(Fm-F)/Fm，它反映了植物目前的实际光合效率。 光照状态下打开饱和脉冲时，电子门被完全关闭，光合作用被暂时抑制，也就是说光化学淬灭被全部抑制，但此时荧光值还是比 Fm 低，也就是说还存在荧光淬灭，这些剩余的荧光淬灭即为非光化学淬灭。淬灭系数的计算公式为：qP=(Fm-Ft)/(Fm-F
5、o)；qN=(Fm-Fm)/(Fm-Fo)；NPQ=(Fm-Fm)/Fm。 最初定义 qP 和 qN 时，认为只有可变荧光（FmFo）会发生荧光淬灭，最小荧光 Fo 不发生淬灭。但是，后来认为当 qN 超过 0.4 时也会有明显的 Fo 淬灭。要正确计算 qP 和 qN，就必须考虑 Fo 淬灭。此时 qP=(Fm-Ft)/(Fm-Fo)；qN=(Fm-Fm)/(Fm-Fo)；北京益康农科技发展有限公司 ECA-YLS02 叶绿素荧光仪- 2 -当 F 达到稳态后关闭光化光，同时打开远红光（Far-red Light, FL）（约持续35 s），促进 PS I 迅速吸收累积在电子传递链中的电子，
6、使电子传递链在很短的时间内回到开放态，F 回到最小荧光 Fo 附近，此时得到的荧光为 Fo。由于在野外测量 Fo不方便，因此野外版的调制荧光仪（除 PAM-2100 和 WATER-PAM 外）多数不配置远红光。此时可以直接利用 Fo 代替 Fo来计算 qP 和 qN，尽管得到的参数值有轻微差异，但 qP 和 qN 的变化趋势与利用 Fo计算时是一致的。由于 NPQ 的计算不需 Fo，近年来应用越来越广泛的。 根据 PS II 的实际量子产量 F/Fm和光合有效辐射（Photosynthetically Active Radiation, PAR）还可计算出光合电子传递的相对速率 rETRYi
7、eld PAR 0.5 0.84。单位是 mol 电子m -2s-1。上式满足如下假设： - Yield 代表全部光合量子产量 - PAR 代表入射到样品的光合有效辐射强度，单位为 molm-2s-1- 传递一个电子需要吸收两个光子，因为光合电子传递需要两个光系统的参与（系数 0.5） - 入射光强有 84被叶片吸收（系数 0.84） 实际上，最后一个假设并不是永远都正确。尽管报道表明许多种植物叶子的吸光系数接近 0.84，但吸光系数还受许多其它因素的影响，如叶片的反射系数、叶绿素浓度和入射光的光谱组成等。在计算 ETR 时应考虑到这些因素的影响。下列是测定和计算的参数：参数 测定 单位 由来
8、PAR 光合有效辐射 molm -2S-1Temp 温度 Fs 恒态荧光 BitsFm 光适应最大荧光 BitsPSII PSII 量子效率 No units （Fm-Fs ）/FmqP 光化学猝灭系数 No units (Fm-Fs)/(Fm-Fo)qNP 非光化学猝灭系数 No units (Fm- Fm)/(Fm-Fo Fm)NPQ 非光化学猝灭系数另一种定义 No units (Fm- Fm)/FmETR 电子传递速率 No units PAR*0.5PSII*0.84注意：有一些计算的参数入猝灭系数的数据不包含在 PSII 测定功能之内。因此可以进行非常有效的 PSII 的测定。同时
9、计算无效的猝灭系数（需要参考暗反应下的测定 Fo 及 Fm） 。PSIIR 功能：对强光的适应可以导致光合机构明显地变化，在能量到达作用中心北京益康农科技发展有限公司 ECA-YLS02 叶绿素荧光仪- 3 -前导致天线能量的非光化学耗散。不能正确解释这一效应就会导致对光化学和非光化学能量耗散相对贡献大小计算的误差。这一问题可以通过对样品瞬间遮光或者用远红光优先激发 PSI 来解决。使电子冲电子传递链中传递出来，有效地开放 PSII 作用中心，能够测定光适应下的 Fo，通常标记为 Fo， PSIIR 功能启动参数 测定 单位 由来PAR 光合有效辐射 molm -2S-1Temp 温度 Fs
10、恒态荧光 BitsFm 光适应最大荧光 BitsFv 光适应可变荧光 BitsFv/Fm PSII 天线效率 No unitsPSIIR PSII 量子效率 No units （Fm-Fs ）/FmqP 光化学猝灭系数 No units (Fm-Fs)/(Fm-Fo)qNP 非光化学猝灭系数 No units (Fm- Fm)/(Fm-Fo Fm)NPQ 非光化学猝灭系数另一种定义 No units (Fm- Fm)/FmETR 电子传递速率 No units PAR*0.5PSII*0.84荧光探头介绍作用光 传感器 远红光 饱和、调制光 北京益康农科技发展有限公司 ECA-YLS02 叶绿
11、素荧光仪- 4 -显示屏 上键 下键 确认键 退出键（探头反） （探头正）荧光测量介绍1、 在仪器的右下角插入 TF 小卡，此卡是用来储存荧光测量数据。2、 把荧光的探头插入到仪器右侧面相对应的插口内。3、 打开仪器主机，这个时候探头上的液晶屏启动（下图）4、 主菜单中包含用户设定和测量设定，用上下键移动黑色光标可选择；用户设定：4-1 时间设定：主要用于实时时间的设定，移动黑色光标主菜单用户设定测量设定北京益康农科技发展有限公司 ECA-YLS02 叶绿素荧光仪- 5 -按 ENT 键进入到时间设定后按上下键设定，设定完成按 ENT 键保存，按 ESC 退出。4-2 光源设置：光源设置包含三
12、种设置模式分别为：调制光束、作用光源、饱和光源； 黑色光标移动到调制光束按 ENT 键进入，设定频率中有 1-5Hz 五种设定由客户自行设定。光强设定中 1-100%用户可以自行设定。设定完成按 ESC 退出。 黑色光标移动到作用光源设定按 ENT 键进入，光强设定中 1-100%用户可以自行设定。设定完成按ESC 退出。 黑色光标移动到饱和光源设定按 ENT 键进入，光强设定中 1-100%用户可以自行设定。设定完成按ESC 退出。4-3 测量间隔设定：设定操作同上，Re 为测量次数，最大可以自动测量 10 次。1-10 之间用户可以自行设定。T1 为调制光开启时间T2 为饱和脉冲光开启时间
13、T3 为作用光开启时间时间设置时间：10:04:51日期：14-12-03北京益康农科技发展有限公司 ECA-YLS02 叶绿素荧光仪- 6 -T4 为饱和脉冲光开启时间T5 作用光开启时间T6 远红外光开启时间开始测量时调制光先开始启动重复闪烁 T1 时间后，饱和光开启 T2 时间后关闭，作用光开启 T3 时间，作用光关闭饱和光开启 T4 时间后关闭，作用光再开启 T5 时间，作用光关闭后远红外光开启 T6 时间。在开启饱和光和作用光同时，调制光一直闪烁。此时一组数据测量完成。T1T6 的设定必须为采集时间的倍数。比如采集时间设定为 30ms 那么 T1 T6 的设定必须能整除 30ms（即
14、为采集时间的倍数）4-4 采集间隔时间：采集间隔主要指仪器在测量一组数据的过程中每个数据保存的间隔时间。4-5 文件名称设定：当多个用户共同使用一台仪器时，用户可以设定自己的用户名来区别。测量设定：测量设定中包含两种测量模式，当进入到这个页面后黑色的光标移动的诱导测量或调制测量上时按 ENT 键开始测量。测量时液晶屏上显示为测量中，当测量完成后液晶屏显示测量数据，等待 5 秒后自动保存。保存后可以再数据浏览中直接看到上组测量的数据。测量模式选择诱导测量调制测量数据浏览北京益康农科技发展有限公司 ECA-YLS02 叶绿素荧光仪- 7 -保存后数据测量完成。可以拿下 TF 卡直接读取数据。4-6 本仪器保存的数据为 EXEL 格式。下面我们来讲解一下如何把 EXEL 中测量的数据来作图分析4-6-1 这是我们得到的调制式荧光测量的数据图4-6-2 我们以样品号为 001 的一组为例，先选择第八行的数测量中Fo=0025Fm=0152Fo、=0350Fm、=0056 Fs=0124北京益康农科技发展有限公司 ECA-YLS02 叶绿素荧光仪- 8 -据点击复制（如下） 然后再新建个空白工作薄，选择 B 列，点击右键找到选择性粘贴（如下）点击选择性粘贴后选择“转置”北京益康农科技发展有限公司
