【精选】DNA与RNA提取方法

《【精选】DNA与RNA提取方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《【精选】DNA与RNA提取方法（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、实验三 Trizol 法提取细菌总 RNA一、实验原理 Trizol 主要物质是异硫氰酸胍,它可以破坏细胞使 RNA 释放出来的同时,保护RNA 的完整性。加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA 存在于水样层中。收集上面的的水样层后 RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。无论是人、动物、植物还是细菌组织 Trizol 法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5 106)以及大量的组织(1 g)和细胞(107)均有较好的分离效果。 Trizol 试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。Trizol 抽提的总 RNA 能够避免 DNA 和蛋白的污染。 2、主

2、要试剂和器材 Trizol 溶液 氯仿 异丙醇 75%乙醇 0.1% DEPC 水 超净工作台 2.0 mL离心管 无 Rnase 移液枪 紫外分光光度计 石英比色皿 泳槽和模具 电泳仪 凝胶成像系统 大肠杆菌 3、实验步骤 一 . 采用 Trizol 溶液提取细菌的总 RNA 1. 挑取大肠杆菌菌单菌落 培养至稳定期 取菌液 2.0 mL 于 2.0 mL 离心管离心得菌体 2、 每管加入 1 mL Trizol 溶液 盖紧管盖 激烈振荡 15 s 室温静置 5 min 4 12000 g 离心 10 min 取上清转入(约 1 mL)新的 2.0 m L 离心管中 3、每管加入 0.2 m

3、L 的氯仿 (0.2 体积 Trizol) 盖紧盖 剧烈振荡 15 s 室温静置 3 min 4, 12000 g, 离心 10 min，小心吸取上层水相转入另一新的2.0mL 离心管，测量其体积,加氯仿时应充分震荡使其充分乳化。 4、加入 1 倍体积的氯仿，盖紧盖，剧烈振荡 15 s，室温静置 3 min，412000 g 离心 10 min 小心吸取上层水相，转入另一已编号新的 2.0mL 离心管。 5、加入 0.5 mL 的异丙醇(0.5 体积 Trizol) 轻轻颠倒混匀，室温静置 10 min，412000 g 离心 10 min，RNA 沉于管底，小心吸去上清 6、加 1 mL75

4、%的乙醇(预冷) ,并轻柔颠倒，洗涤沉淀 4 7500 g 离心 5 min,小心弃上清，微离吸去剩余乙醇，室温干躁 10 min。7、 各管用 30L DEPC 处理过的双蒸去离子水溶解， 55-60温育 5 min，分装，-80 贮存( 可贮存 5 周)。 二 . RNA 浓度的测定 取 10 L RNA 样品以双蒸水稀释至 2 mL 转入预先以无水乙醇隔夜浸泡后晾干的石英比色皿中，小心排除气泡，以等体积的双蒸水作为空白对照。在紫外分光光度计中分别测定 260 nm、280 nm 的光吸收值。根据公式计算 RNA 的浓度。 RNA 浓度(g/L)= OD260 稀释倍数(200) 40(g

5、/mL)/1000 纯 RNA 样品的 OD260/OD280 比值为 1.82.0 若低于该值，表明存在蛋白质污染 ，可重新用酚氯仿抽提。该值为 2.0 时 RNA 纯度为最高。 三 . RNA 质量检测 将 RNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测，目的在于检测 23 S 和 16S 条带的完整性和它们的比值。一般认为 如果 23 S 和 16 S 条带明亮、边缘清晰 并且 23 S的亮度在 16 S 条带的两倍以上 则 RNA 的质量较好。(1) 将洗净、干燥的电泳槽和模具 水平放置在工作台上 (2) 准确称取 0.15 g 琼脂糖加入 15 mL 1 TAE 中,摇匀,在微波炉内将琼脂糖溶液以最

6、短时间完全溶解(中火档 2 min),待冷却至 60时,加入 EB(终浓度为 L/mL),充分混匀。 (3) 插入适当的梳子，将温热的凝胶倒入胶模中，凝胶厚度为 35 mm，置于室温下凝固。(4) 待凝胶凝固后，小心移去梳子，将凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液使液面高出凝胶 12 mm。(5) 用微量移液器将样品 8L 与上样缓冲液 2L 混合并将混合液小心加入上样孔内，同时加入合适分子量范围的 DNA 分子量标准作为对照 2000bp。 (6) 盖上电泳槽盖 调节电压 100 V 电泳 15min 左右。(7) 电泳完毕后将凝胶置于紫外透射检测仪上观察结果 用凝胶成像系统照相保存。 四、注意

7、事项 1. RNA 制备的关键是要抑制细胞中的 RNA 分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA 分解酶的污染。EP 管及 Tip 头都要用 0.1%处理(0.1% DEPC 浸泡过夜后高压蒸气灭菌)。用于 RNA 实验的试剂 须使用 DEPC 水处理灭菌后的玻璃容器盛装 使用的无菌水须用 0.1%的 DEPC 处理后再进行高温高压灭菌。最好在超净台内操作。 2、提取时操作带一次性手套、口罩等 小心、细致、晃动及每次移液要轻 在操作过程中避免讲话等。这样做的唯一目的就是两个：一是小心 RNAse 的污染降解 RNA 二是动作过度暴力破坏 RNA 的完整性。 3、电泳液需新鲜配制。电泳槽和模具需预先

8、进行处理。 4. 一般 RNA 电泳应该是做甲醛变性电泳 但是一般的琼脂糖电泳也可以 需要上样量稍微大些 并且跑电泳的时间越短越好(这样也是为了减少外界 RNAse对 RNA 的降解) 跑完电泳立刻观察。 5、需要用 EB 染色，Genefinder 染色效果不好，其对双链 DNA 的效果好。 6、器材的处理 尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。 （1） 用 0.1% DEPC 焦碳酸二乙酯水溶液在 37 下处理 12 小时。 （2） 然后在 120下高压灭菌 30 分钟以除去残留的 DEPC。RNA 实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。实验二 细菌 D

9、NA 提取方案一、实验原理要进行重组 DNA 实验，就离不开外源基因的纯化，而外源基因主要来源之一就要直接从生物的染色体 DNA 上制备，所以制备高质量的染色体 DNA 样品经常为基因工程实验所需要。 作为基因工程的载体必须满足下面四个条件：1.是一个复制子，有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；2.他必须要有很高的复制率，这样才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；3.有限制性内切酶的识别位点，便于外源基因的插入；4.载体具有选择的遗传标识，以此判断载体是否进入受体细胞，并将其分离出来。因此 基因工程实验所需要的基因组 DNA 通常要求分子量尽可能大，以此增加外源基因获得率，但要获得大片段的

10、 DNA 非易事。对于细菌来说，细菌细胞具有坚硬的细胞壁，提取难度将大于真核细胞。 细菌基因组 DNA 在抽提过程中，不可避免的机械剪切力必将切断 DNA，如果要抽提到大的 DNA 分子，就要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA 分子的可能性；分子热运动也会减少所抽提到的 DNA 分子量，所以提取过程也要尽可能在低温下进行。另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的 DNA，所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。 （温和操作） 。 另外制备的 DNA 必须是高纯度的，以满足基因工程中各种酶反应的需要，制备的样品必须没有蛋白污染，没有 RNA，各种离子浓度应符合要求，这些在染色体

11、制备时都应考虑到。DNA 不溶于 95%的酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的 DNA。 并且用酒精可以洗脱在前几步实验中使 DNA 携带的盐离子。对于细菌而言，有染色体 DNA 和质粒 DNA，因此要将其分离开。处理过程中，细菌染色体 DNA 缠绕在细胞膜碎片上，离心时容易被沉淀下来，而质粒 DNA 则留在上清液中，上清液中还可能有蛋白质，核糖核蛋白和少量的染色体 DNA。 大肠杆菌染色体 DNA 抽提首先收集对数生长期的细胞，然后用离子型表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）破裂细胞，SDS 具有的主要功能是：（1）溶解细胞膜上的脂类和蛋

12、白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜； （2）解聚细胞膜上的脂类和蛋白质，有助于消除染色体 DNA 上的蛋白质； （3）SDS 能与蛋白质结合成为 R10SO3R2蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。 SDS 也能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它除干净。以免影响下一步 RNase 的作用。破细胞后 RNA 经 RNase 消化除去，蛋白质经苯酚、氯仿异戊醇抽提除去。含有质粒 DNA 的上清液用乙醇或异丙醇沉淀，回收 DNA。 此种方法抽提的细菌染色体 DNA，无 RNA 和蛋白质污染，可用于限制性内切酶消化，分子再克隆等。但在下一步实验前，要测定其 DNA 的浓度，常用测

13、定 DNA 浓度的方法，是溴化乙锭电泳法；当 DNA 样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入的 EB 会增强发射的荧光。而荧光的强度正比于 DNA 的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估计出待样品的浓度。 本实验利用的就是使用裂解液（含去污剂 SDS）将细胞壁破坏，裂解后，用乙醇将 DNA 沉淀下来。 二、实验材料LB 液体培养液 酚/氯仿（1：1）：一般市售的酚需要重蒸处理，市售的酚常含有杂质而呈粉色和淡黄色，需要重蒸二次，收集沸点 160部分，小瓶分装，瓶内空腔充氮气，20密封保存，以免氧化，用前从冰箱中取出，68蒸馏水饱和，加入8羟基喹啉（100g 酚加 0.1g） ，酚变为黄色。8羟

14、基喹啉是抗氧化剂，并能部分抑制核糖核酸酶，含 8羟基喹啉的酚用等体积 1.0mol/L pH 8.0Tris 缓冲液抽提，再用 0.1mol/L pH 8.0 含 0.2巯基乙醇的 Tris 缓冲液抽提数次，酚溶液的 pH 应大于 7.6。此酚溶液在平衡缓冲液覆盖下 4可保存一个月，纯化和制备酚溶液都要带手套，以免损伤皮肤。 核糖核酸酶：无 DNA 酶污染，将胰 RNA 酶（RNA 酶 A）溶于10mmol/LTrisCl(pH 7.5)15mmol/L Nacl 溶液中，浓度为 10mg/ml.于 100加热 15 分钟，缓慢冷却至室温，分装后于20保存。TEG 缓冲液： pH8.0 25m

15、 mol/L Tris-HCl,10m mol/L EDTA,50m mol/L 葡萄糖,4mg/mL 溶菌酶标准菌株：大肠埃希氏菌 碱裂解液：0.2mol/L NaOH,1%SDS 乙酸钾溶液、乙酸钠溶液、溶菌酶溶液、丙酮溶液。 三、方法与步骤1) 将大肠杆菌接种于 LB 培养基在 37C 环境下，以 150r/min 震荡过夜培养。 2) 取 1ml 对数期菌液，12000rpm 5min； 3) 弃上清，将沉淀溶于 200ul 丙酮，震荡混匀，冰浴 5min。 4) 8000rpm 离心 2min，弃上清。 5) 将沉淀混于 TEG 缓冲液中，震荡混匀，冰浴 5min 6) 加入 200

16、ulSDS 裂解液，冰浴 5min 7) 加入 150ul 乙酸钾溶液，冰浴 15min，使其沉淀完全。 8) 4C 下离心， 12000rpm，5min。 （乙酸钾能沉淀 SDS 与蛋白质的复合物，并使过量的 SDS-Na+转化为溶解度很低的 SDS-K+一起沉淀下来。 ）离心后，若上清液浑浊，应混匀后再冷至 0C，重复离心，弃去上清。9) 加入等体积的酚-氯仿饱和溶液，反复震荡，离心，12000rpm 2min（比单独用酚，氯仿除去蛋质效果更好。为充分除去残余的蛋白质，可以进行多次抽提，直至两相间无絮状蛋白沉淀） 。 10) 将上清移至新管，加入 2 倍体积预冷无水乙醇，混合摇匀。 11) -20C，15min 后，4C 下离心