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1、1前列腺组织二氢睾酮结合蛋白与性激素作用的研究【摘要】目的测定前列腺组织中 DHT 结合蛋白的 DHT 结合容量，研究睾酮、雌二醇、孕酮对 DHT 结合容量的影响，初步分析 DHT 结合蛋白与性激素作用的性质。方法 20 例正常前列腺组织，制备组织胞浆提取液，乙醚萃取去除提取液中所有的内源性类固醇激素，加入 3H-DHT 测定结合容量，并以等量和 10 倍量的T、E2、Po 与 3H-DHT 竞争 DHT 结合容量。结果前列腺组织胞浆单纯 DHT 结合容量是(0.01430.0022)nmol/g 湿组织，T、E2 与 DHT 竞争结合蛋白的作用较强，降低 DHT 结合容量的作用比较明显，Po
2、 的结合作用较弱，对结合容量的影响较小。结论前列腺组织胞浆中的 DHT 结合蛋白组成复杂，性质各异，有很强的结合DHT 能力，与 T、E2、Po 相互作用，共同影响前列腺组织中 DHT 的状态。【关键词】前列腺雄激素雌激素孕激素雄激素结合蛋白【Abstract】ObjectivesThisexperimentistoquantifythetotalDHT(Dihydrotestosterone)-bindingabilityofDHT-bindingproteinsinprostatebyassayingtheDHT-bindingcapacity,andtostudythechangeofD
3、HT-bindingcapacitycausingbythecombinationofT（Testosterone）,E2(Estrodiol),Po(Progestosterone)andDHT-bindingprotein,andtoanalyzepreliminarilytheeffectsofsexhormoneonDHT-bindingproteinofprostate.MethodToobtaincytosolicfracionsfrom20normaltissuestakenfromaccident-deathcorpseswithoutseriousdiseases,andth
4、entoremovealltheendogenoushormonefromthecytosolicfracionsbyetherstripping.Toassaythecontentofthebound3HDHT.ToaddthesamedoseofT、E2、Potocompeteagainst3HDHTforDHTprotein,andthentoadd10timesdoseofT、E2、Potocompetewith3HDHTforDHTprotein.ResultsThealoneDHT-bindingcapacityofthecytosolicfractionsinprostateis
5、(0.01430.0022)nmol/gwettissue.TandE2havemoreobviouseffectonreducingtheDHT-bindingcapacityofthecytosolicfractionwhilePohaslesseffectonreducingtheDHT-bindingcapacity.ConclusionsTherearemanykindsofDHT-bindingproteinsinthecytosolicfractioninprostatetissuesandtheirmechanismsaredifferent.Theproteinshavest
6、rongDHT-bindingcapacity,andtheyinteractwithT、E2、PotoaffecttheDHTstateintheprostatetissues.【Keywords】ProstateAndrogenEstrogenProgestosteroneAndrogen-bindingprotein 前列腺组织中存在多种二氢睾酮（Dihydrotestosterone，DHT）结合蛋白 ，这些蛋白的性质和生理作用尚不十分明确。作者自 2001 年 2 月至 2007 年 5 月实验设计测定 DHT 结合容量来描述这些结合蛋白总的 DHT 结合能力，并以睾酮(CT)、雌二
7、醇(E2)、孕酮(PO)与DHT 竞争结合蛋白的作用研究正常前列腺 DHT 结合容量的变化，并初步分析 DHT2结合蛋白与性激素作用的性质。1 材料和方法1.1 前列腺组织标本 20 例正常前列腺组织取自无严重疾患的健康男性尸体，年龄 2244 岁，平均 35.7 岁。组织块获取距临床诊断死亡时间15min。所有组织均经病理证实。组织获取后以冰生理盐水洗净血迹，保留腺体实质部分，滤纸吸干，置入液氮中冻结，然后转放-70冰箱存放待用。1.2 试剂 3H-DHT 购自中国科学院上海核技术开发公司（1.2.4.53H-DHT，放射性比强度：50ci/mmol，放化纯度：95%，放射性浓度：1mci/
8、mmol） ，检测仪器为 BECKMAN 公司 LS-6500 型液态闪烁记数仪。E2、T、PO 为 SIGMA 公司产品。1.3 实验方法(1)胞浆提取液准备：制备胞浆提取液 ，去除胞浆提取液内源性类固醇激素，将胞浆提取液加入 2 倍体积的乙醚（萃取类固醇激素） ，均匀而柔和震荡 2min，静置 6h，1000g 离心 1min，去除上层乙醚，重复 1 次，去乙醚后，静置过夜，以挥发残余乙醚，吸取所需量的下层样品。(2)3H-DHT 结合和测定：3H-DHT 溶液准备：0.4ml3H-DHT 试剂加入 1.2ml99%乙醇混匀，取 50l溶于 4950l 甘油磷酸盐缓冲液1nM 磷酸二氢钾(
9、KH2PO4)，氢氧化钠(NaOH)微调至 pH7.4，含 10%甘油(Glycerol)(v/v) ，3H-DHT 终浓度为 50nM。T、E2、Po溶液：先配置 5mmpH 激素浓度的异丙醇溶液，用 99%乙醇稀释 10 倍，再以上述甘油磷酸盐缓冲液稀释 1000 倍，此浓度 500nM，为 3H-DHT 溶液浓度的 10 倍，留取一部分备用；另一部分继续甘油磷酸盐缓冲液稀释 10 倍，浓度 50nM，等同于 3H-DHT 溶液浓度，备用。另配不含任何激素的空白对照溶液，过程同。闪烁液：PPO6g、POPOP0.3g、萘 50g 溶于甲苯 1000ml。操作步骤：取已去除内源类固醇激素的样
10、品，每一样品分为 4 份，每份 350l，分别加入 20l 空白对照溶液、50nM 的 T 溶液、50nM 的 E2 溶液、50nM 的 Po 溶液，然后所有样品溶液均加入 3H-DHT 溶液 20l，混匀，静置孵育 18h。加入 2 倍体积的乙醚，均匀而柔和震荡 2min（萃取未结合的 3H-DHT） ，1000g 离心 1min，去除上层乙醚，吸取200l 下层样品。实验同时以 2 份 350lPGB 缓冲液各加入 20l3H-DHT 溶液分别作为空白对照记数（步骤同前）和总记数（略去乙醚萃取步骤，其余同前） 。以上全部操作在 4进行。将吸取的 200l 样品加入蛋白酶 K（终浓度 100
11、g/ml） 、SDS（终浓度 0.5%） ，37过夜，加入 5ml 闪烁液，轻微震荡 2h 做液闪记数。以上为等量激素的竞争结合实验，再用 500nM 的 T 溶液、E2 溶液、Po 溶液替换相应的激素溶液，其余步骤同，做 10 倍激素的竞争结合实验。根据已知 3H-DHT 含量的计数：（总记数cpm-空白对照 cpm） ，和待测样品的计数：（样品 cpm-空白对照 cpm）计算样品结合 3H-DHT 含量。实验为同一样品不同处理的自身配对设计，统计分析为 t 检验。2 结果32.1 前列腺组织胞浆单纯 DHT 结合容量是(0.01430.0022)nmol/g 湿组织，均数相当于 4.2ng
12、/g 湿组织。2.2 与 DHT 等量性激素对胞浆 DHT 结合容量的影响，见表 1。加入 T 或 E2的 DHT 结合容量低于单纯 DHT 结合容量，有显著性差异（P0.05） ，Po 的作用无显著性差异（P0.05） 。等量时 T 和 E2 作用的 DHT 结合容量低于 Po，有显著性差异（P0.05） 。2.310 倍于 DHT 量性激素对胞浆 DHT 结合容量的影响见表 1，不但 T 或 E2 作用的 DHT 结合容量低于单纯 DHT 结合容量，Po 作用下的结合容量也低于单纯 DHT结合容量，均有显著性差异（P0.05） 。表 120 例标本性激素对 DHT 结合容量的影响（nMol
13、/g 湿组织）3 讨论二氢睾酮(DHT)是影响前列腺生理和引起前列腺组织增生最重要的雄激素 ，前列腺组织中有高浓度的 DHT，含量达到 500ng/100g 湿组织，而血浆DHT 含量仅有（5620）ng/100ml(每 100g 前列腺湿组织的体积约等于 100ml)，其中游离 DHT 极微量 ，由于 DHT 是甾体激素，其游离状态易于依浓度梯度扩散进入/逸出组织细胞，有研究表明，前列腺组织中除外雄激素受体，还有多种 DHT 结合蛋白 ，其中有高亲和力的性激素结合球蛋白 ，组织中这些蛋白的存在可能起到类似血浆中白蛋白和性激素结合球蛋白的对雄激素的结合聚积作用，在组织中的游离 DHT 环境结合
14、大量 DHT 形成“DHT 库” ，同时，蛋白与DHT 的结合减少了局部游离 DHT 的浓度，有利于产生血浆游离 DHT 被动扩散进入组织的浓度梯度，易于前列腺利用外源的 DHT，更促使组织中 DHT 的富积，便于其发挥生理作用 。然而这些蛋白的作用和性质还知之甚少。胞浆是 DHT 产生和贮存的主要场所，而胞核是 DHT-雄激素受体启动转录的部位，因此实验设计主要研究胞浆中的 DHT 结合蛋白的作用性质。实验结果，前列腺组织胞浆的 DHT 结合容量为(0.01430.0022)nmol/g 湿组织，均数大约为 4.2ng/g 湿组织，比较血浆中 DHT 含量仅有(0.560.20)ng/ml（
15、其中游离 DHT 极微量） ，提示前列腺组织胞浆有很强的 DHT 结合能力，利于局部摄取和贮存 DHT（包括胞浆局部产生和血浆来源） ，最终有利于 DHT 进入胞核与受体作用。T、E2、Po 对胞浆 DHT 结合容量的影响，DHT 结合容量只是反映结合 DHT 的量，由于结合蛋白的非特异性（如前列腺组织中的性激素结合球蛋白 ） ，在生理条件下实际结合 DHT 可能会受到其他激素（如雄激素、雌、孕激素）的影响，因此，从 DHT 结合蛋白与多种性激素的作用初步分析这些蛋白与激素的作用。等量 T、E2、Po 与 DHT 的竞争作用：与单纯 DHT 结合容量相比较，在同 DHT等量存在的 T、E2 竞
16、争作用下，结合容量显著降低，Po 虽然降低了结合容量，但无显著性差异。说明 T、E2 具有明显的与 DHT 竞争结合蛋白的作用，提示在DHT 结合蛋白中存在着与 E2 亲和力较高的蛋白（性激素结合球蛋白即是其一） ，由于雌激素以协同 DHT 诱导前列腺组织的生长 ，因此 E2 参与竞争结合胞浆DHT 结合蛋白的作用可能是一种雌雄激素协调机制，有关与 E2 结合的这类蛋白4的性质和作用机制值得研究。而比较这 T、E2 与 DHT 竞争结合蛋白的作用结果，E2 作用的 DHT 结合容量略低于 T 的作用，无显著性差异。DHT 结合蛋白与 T、E2、Po 具有亲和力的性质，提示了蛋白组成的复杂性以及同类固醇激素作用的广泛性；同时，T、E2、Po 与 DHT 结合蛋白的竞争结合将影响到局部游离 DHT 的含量，可能会对 DHT 的生理作用产生影响。【参考文献】1 江洪涛,陈昭典.前列腺组织性激素
