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1、1前列腺特异性抗原启动子调控促凋亡基因 caspase作者：张更，王禾，张波，于翠娟，武国军，秦卫军，孟艳玲，王成济，杨安钢【关键词】,前列腺肿癌【Abstract】AIM：Toconstructtheeukaryoticexpressionvectorthatspecificallydrivespro-caspase-7byprostate-specificantigenpromoter.Byemployingtheprostate-specificantigenpromoter(PSAP),weinvestigatedwhetherPSAPdrivenprocaspase7couldind
2、ucedeathofprostatecancercellsandwhetherthecytotoxicitywasrestrictedtocellsofprostateorigin.METHODS:WeextractedgenomicDNAfrombenignprostatetissuesandobtainedprostatespecificantigenpromoter（PSAP）fragmentbypolymerasechainreaction(PCR).Usinggenetechnology,wereplacedthepCMVonpCDNA3byPSAPandobtainedPSAPpC
3、DNA3vector.ThenthepCMVonpIRES2EGFPandpIRES2EGFPCsp7wasreplacedbyPSAPaftertheconfirmationofitssequenceandPSAPpIRES2EGFPandPSAPpIRES2EGFPCsp7eukaryoticexpressionvectorswereobtainedrespectively.Lipofectionmediatedgenetransferswereperformedwiththetwoobtainedvectorsandacontrolplasmid,pIRES2EGFP,inhumanpr
4、ostatecancercelllinePC3mand2othercelllines(Hep2humancanceroflarynxandMC3T3micefibroblast).Lightandelectronmicroscopywereusedtoobservetheproliferationandapoptosisofallcelllines.APSAPdrivenEGFPwasalsousedtoestimatetheexpressionofthePSAPdriventranscripts.Immunohistochemistrymethodswereusedtoevaluatethe
5、expressionofcaspase7protein.RESULTS：AlltheconstructedvectorswereverifiedbyenzymedigestionandDNAsequencing.AftertransfectedwithpIRES2EGFP,PC3m,Hep2andMC3T3allshowedgreenfluorescence.AftertransfectedwithPSAPpIRES2EGFP,onlyPC3mshowedgreenfluorescenceandnoapoptosiscellsappearedinallthethreetransfectedgr
6、oups.AftertransfectedwithPSAPcaspase7pIRES2EGFP,PC3mshowedthestronggrowthinhibitionbuttheothertwocelllinesshowednochanges.Nocaspase7wasdetectedintheHep2andMC3T3celllinesaftertransfection.Morphologically,someofthePC3mtransfectedcellsmanifestedapoptoticfeatures.CONCLUSION:PSAPdrivenprocaspase7genether
7、apyinhibitsthegrowthofhumanprostatecancercellsandthecytotoxiceffectisrestrictedtothecellsofprostateorigin.【Keywords】prostaticneoplasms；regions(genetics)promoter；apoptosis；cloning,molecular【摘要】目的：构建前列腺特异性抗原启动子（PSAP）调控的促凋亡基因caspase7 表达载体并观察其对前列腺癌细胞的促凋亡作用.方法：提取基因组DNA，通过 PCR 法获得前列腺特异性抗原启动子（PSAP）基因，利用基因重
8、组方法以 PSAP 替换掉 pCDNA3 真核表达载体中的 pCMV 启动子，构建 PSAPpCDNA3 载体.测序正确后，将 PSAP 分别替换绿色荧光蛋白载体 pIRES2EGFP 和克隆入带有效应型caspase7 基因的绿色荧光蛋白载体 pIRES2EGFPCsp7 中的 pCMV 启动子片段，分2别获得由 PSAP 启动子调控的绿色荧光蛋白载体和带有效应型 Caspase7 基因的真核表达载体 PSAPpIRES2EGFPCsp7.利用脂质体转染法将该载体分别转染至PC3m（前列腺癌） 、Hep2（喉癌）及 MC3T3（正常成纤维）细胞中，通过荧光显微镜观察转染细胞绿色荧光蛋白表达及
9、细胞形态变化，免疫组化检测细胞中效应型 caspase7 蛋白的表达状况，细胞计数观察转染不同表达载体后各类细胞生长变化.结果：经酶切鉴定及测序结果证实所构建载体正确.转染PSAPpIRES2EGFPCsp7 载体后，在 PC3m 细胞中可观察到绿色荧光蛋白的表达，并可检测到效应型 Caspase7 蛋白表达，而在 Hep2 及 MC3T3 细胞中未观测到绿色荧光，荧光显微镜下可见前列腺癌 PC3m 细胞生长受到抑制并出现凋亡细胞形态，细胞计数证实转染的 PC3m 细胞生长受到抑制，而其余细胞生长未受影响.电镜观察结果显示转染 PSAPpIRES2EGFPCsp7 后的 PC3m 细胞出现典型
10、的凋亡细胞形态.结论：前列腺特异性抗原启动子（PSAP）可在前列腺癌细胞中特异性调控其下游 caspase7 基因的表达，并发挥其促凋亡作用，从而特异性地诱导前列腺癌细胞发生凋亡，而对正常细胞及非前列腺起源细胞不产生影响.【关键词】前列腺肿癌；启动区（遗传学） ；脱噬作用；克隆，分子0 引言目前，前列腺癌的检出率逐年增高，在欧美等西方国家，前列腺癌是男性最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率仅次于肺癌居第二位.近几年资料显示，我国前列腺癌发病率逐年上升，目前在我国的发病增长率已居泌尿生殖系恶性肿瘤增长率首位.因此，人们试图尝试治疗前列腺癌的有效方法.前列腺特异性抗原特异性表达于来源于前列腺上皮的各类
11、细胞，包括正常、增生及发生癌变的前列腺细胞，针对这种表达特异性，我们构建了前列腺特异性抗原启动子（PSAP）调控的促凋亡基因 caspase7 活化结构的真核表达载体，转染至前列腺癌细胞，观察该重构的表达载体对前列腺癌细胞生长状况的影响及前列腺癌细胞发生凋亡状况，为前列腺癌的基因治疗方法提供新的思路和途径.1 材料和方法1.1 材料前列腺癌 PC3m 细胞株由唐都医院杨杰硕士惠赠，喉癌的上皮细胞株 Hep2 及正常成纤维细胞 MC3T3 以及效应型 caspase7 载体由本校分子生物学实验室于翠娟博士惠赠.绿色荧光蛋白载体 pIRES2EGFP 购自 Clontech 公司.脂质体购自 Gi
12、bco 公司产品，质粒提取试剂盒购自上海华舜生物工程公司.1.2 方法1.2.1 载体构建按分子克隆实验指南方法从增生的前列腺组织中提取基因组 DNA，按文献设计引物 1，利用 PCR 反应扩增获得具有 Bgl和 Hind酶切位点的前列腺特异性抗原启动子（PSAP）片段，酶切替换 pCDNA3 载体的 pCMV 启动子，构建 PSAPpCDNA3 载体，酶切鉴定并送公司测序.利用引物 2 从 PSAPpCDNA3 载体中通过 PCR 反应获得具有 Nru和 Vsp酶切位点的 PSAP 片段，通过 Nru和 Ase酶切位点替换 pIRES2EGFP 的启动子 pCMV片段，构建由 PSAP 调控
13、的 PSAPpIRES2EGFP 载体.酶切鉴定及测序鉴定正确后保留该载体，然后在 PSAPpIRES2EGFP 载体的 EcoR和 BamH两酶切位点间插入已克隆成功的效应型 caspase7 片段，构建重构型 PSAPCasp7pIRES2EGFP 载体，酶切鉴定并测序.引物 1：5tttagatcttagaggatctgtggaccacaa35tttaagcttggtgacacagctctccgggtg33引物 2：5tttattaattcgcgattttatgatgacagtagcaat35tttgaattcggggctggggagcctccccca31.2.2 细胞培养用含 100m
14、LL-1 新生小牛血清的 1640 培养液培养PC3m 细胞及 Hep2 细胞，用含 100mLL-1 新生小牛血清的加谷氨酰胺及双抗的 DMEM 培养液培养 MC3T3 细胞，所有细胞置于 37，50mLL-1CO2 培养箱中培养.1.2.3 质粒的提取、纯化及定量所获得的 PSAPpIRES2EGFP 质粒和重构型PSAPCasp7pIRES2EGFP 质粒在大肠杆菌 DH5 中转化，卡那霉素阳性琼脂培养基中扩增，用质粒提取试剂盒提取纯化质粒 DNA，紫外分光光度计测定纯度并定量.1.2.4 细胞转染实验分为空载体 pIRES2EGFP 转染组，PSAPpIRES2EGFP 载体转染组，P
15、SAPpIRES2EGFPCasp7 载体转染组，取 PC3m，Hep2，及 MC3T3 细胞进行细胞爬片，分别于 12，24，48 和 72h 后转染以上 3 种质粒，PBS 洗涤细胞，40mLL-1 多聚甲醛固定，荧光显微镜下观察转染结果.转染方法参照LipofectAMINETM2000 说明书.样品处理及荧光激发波长的选择均参照pIRES2EGFP 载体产品的UserManual.1.2.5 电镜观察收集转染细胞，细胞沉淀用 25mLL-1 戊二醛 4固定 2h.拨离细胞团块，PBS 洗两遍，脱水、包埋，制备超薄切片，染色，水洗，透射电镜观察并照相.1.2.6 免疫组化方法检测 cas
16、pase7 表达 SABC 法检测转染PSAPCasp7pIRES2EGFP 后各组细胞中 caspase7 蛋白的表达状况.统计学处理：采用方差分析.2 结果2.1 提取质粒 DNA 纯度测定提取质粒 DNA 纯度用紫外线分光光度计测定,A260/A280 定于 1820.2.2PSAPPCDNA3 载体构建用 Bgl和 Hind酶切重组载体，应获得 602bp 的PSAP 片段，PSAP 片段中有 Nhe酶切位点，用 Bgl和 Nhe酶切该重组载体，可见 402bp 的酶切片段.经测序，证实所得序列与 GengBank 中 PSAP 序列完全一致.2.3 重构型 PSAPCasp7pIRES2EGFP 载体酶切鉴定结果用 Vsp和 BamH酶切重构型 PSAPCasp7pIRES2EGFP 载体，应获得 15kb 的 PSAPcaspase7 片段.用EcoR和 BamH酶切后获得 912bp 的 caspase7 片段.用 Vsp和 EcoR酶切后获得 602bp 的 PS
