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1、1利用 siRNA 抑制人骨肉瘤细胞 survivin 的表达作者：李鲲，杨述华，刘红云，傅德皓，宁旭，梅荣成【摘要】 目的 构建生存素（survivin）短发夹状 RNA 表达载体，检测其对骨肉瘤细胞 survivin mRNA 及蛋白表达的影响。方法 体外构建 survivin shRNA 表达载体 pSilence2.1neosurvivin, 转染骨肉瘤细胞系 MG63 ，RTPCR 、免疫组化方法检测转染前后 survivin mRNA 及蛋白的表达，MTT 比色法检测细胞增殖活性。结果 pSilence2.1neo survivin 载体转染能显著抑制 survivin mRNA、
2、蛋白表达，转染后 48h 细胞增殖的抑制率为 61.83%。结论 pSilence2.1neosurvivin 可显著抑制 MG63 细胞 survivin mRNA、蛋白的表达及细胞的增殖活性。 【关键词】 survivin；RNA 干扰；短发夹 RNA；骨肉瘤Inhibition of the Expression of survivin in Osteosarcoma Cell by A Short Hairpin RNAKey words：survivin；RNA interference；Short hairpin RNA；OsteosarcomaRNA 干扰（RNA interfe
3、rence，RNAi）是一种新兴的转录后基因阻断技术, 可以简单、有效、特异地下调细胞中目的基因的表达。我们以 survivin 为靶点，体外构建短发夹状 RNA 的表达载体, 观察其对 MG63 细胞 survivin 基因表达的影响，为骨肉瘤基因治疗的进一步研究提供实验基础。1 材料与方法1.1 材料人骨肉瘤细胞系 MG63 为本教研室保存，Lipofectamine 2000 为Invitrogen 公司产品，pSilence2.1neo 为 Ambin 公司产品， RTPCR 试剂盒为 MBI 公司产品，鼠抗人 survivin 单克隆抗体及 SP 试剂盒为 Santa Cruz 公司
4、产品。1.2 实验方法1.2.1 pSilence2.1neosurvivin 表达载体构建及细胞转染 参照Harborth 等1的干涉 RNA 设计原则，以人 survivin 的 mRNA 序列5TTCGTCCGGTTGCGCTTTC 3为靶点，体外合成两端带有 BamH和 Hind粘端酶切位点、内含5TTCGTCCGGTTGCGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCGCAACCGGACGAA3 发夹状序列的2双链 DNA，将合成的片段接入 pSilence2.1neo 载体，筛选、扩增后经测序证实构建成功。分 4 组进行细胞转染处理：空白组、脂质体组、空载体组、shRNA组。1.2.2
5、 RTPCR 检测细胞 survivin mRNA 的表达 分别收集转染24、48、72h 细胞, 提取细胞总 RNA，并进行逆转反应。引物的序列为： survivin：上游：5ATGGGTGCCCCGACGTTG3 下游：5AGAGGCCTCAATCCATGG3 ，扩增产物 436bp。actin ：上游：5TGGCATTGCCGACAGGATGCAGAA3 下游：5CTCGTCATACTCCTGCTTGCTGAT3 ，扩增产物 172bp。以 survivin 与actin 条带的积分吸光度（IA）比值表示 survivin mRNA 的相对含量。1.2.3 免疫组化法检测 survivi
6、n 蛋白的表达 按上法处理细胞24、48、72h 后，SP 法进行免疫组化染色。以细胞浆和/或核呈现棕黄或棕褐色颗粒为阳性细胞，并计算阳性表达率：阳性表达率=（每 500 个细胞中阳性细胞数/500）100%。1.2.4 MTT 法检测细胞增殖活性 按上法处理细胞 24、48、72、96h 后，行MTT 染色，测 OD 值，计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率=（空白组 OD 值处理组 OD 值）/空白组 OD 值100%。1.3 统计学处理采用 SPSS10.0 统计软件，对数据进行 t 检验。2 结果2.1 RTPCR 结果shRNA 组 436 bp 处的条带亮度显著低于其余各组，见图 1
7、，与空白组相比shRNA 组 24、48、72h mRNA 表达抑制率分别为 68.52%、74.87%和 71.93%， 其抑制作用在 2448h 逐步增加，4872h 有所减低，余各组之间无明显差别，见表 1。表 1 survivin shRNA 对 MG63 细胞 survivin mRNA 表达的影响 2.2 免疫组化结果空白组、脂质体组、空载体组多数细胞中均出现明显的棕黄色的颗粒状细胞浆和/或核着色，见图 2，而 shRNA 组细胞着色较淡，阳性细胞数目较少，见图 3。 统计结果显示，shRNA 组 survivin 蛋白表达明显低于其他组，见表 2。表 2 survivin shR
8、NA 对 MG63 细胞 survivin 蛋白表达的影响2.3 MTT 比色法比较细胞增殖活性与空白组相比，载体转染后 24、48、72、96h 细胞的增殖活性均受到了显著抑制，48h 抑制率最高，为 61.83%。其他组间细胞的增殖情况的差异无统计学3意义，见表 3。3 讨论RNAi 是指在生物体细胞内，外源性或内源性的双链RNA（doublestranded RNA, dsRNA）引起同源 mRNA 特异性的降解，从而高度特异性、高效性地抑制目的基因表达的技术。利用 siRNA 干涉技术特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这些基因保持在静寂或休眠状态，可表 3 MTT 法
9、检测 shRNA 对 MG63 人骨肉瘤细胞增殖的抑制作用达到抗肿瘤作用。Lin 等2利用 RNAi 技术使 bcl2 基因静寂，从而抑制了前列腺癌LNCaP 细胞的生长，并可见到染色体浓缩、基因组 DNA 断裂等细胞凋亡的特征性变化；Elbashir 等3将体外合成的特异性 siRNA 转染入人宫颈癌 Hela 细胞， 结果发现其靶向 mRNA 所表达的蛋白质的量比转染前降低了 90%。survivin 是迄今发现最强的凋亡抑制因子，属于凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）家族的新成员。survivin 表达于胚胎和发育的胎儿组织，在终末分化
10、的成人组织中不表达（胸腺除外） ，但在人类大多数的恶性肿瘤组织中高表达且与肿瘤的恶性程度及预后密切相关4，5 。其通过抑制凋亡通路末端的效应子 caspase3 和 caspase7 而阻断各种刺激（如 Fas、caspase、bax、化疗药物）诱导的肿瘤细胞凋亡过程6 。 采用反义技术阻断肿瘤细胞 survivin 基因的表达可抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡、增强化疗或放疗的敏感性，故此 survivin 基因已成为当前肿瘤基因治疗研究的热点。本研究设计并构建了针对 survivin 的 shRNA 表达载体pSilence2.1neosurvivin ，并证实该载体转染可以显著抑制 MG6
11、3 细胞中survivin mRNA 及蛋白的表达并显著抑制 MG63 细胞的增殖活性，为靶向survivin 基因进行骨肉瘤基因治疗的进一步研究提供了实验基础。【参考文献】1 Harborth J，Elbashir SM， Bechert K，et al. Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAsJ. J Cell Sci，2001, 114(Pt 24): 45574565.2 Lin SL, Chuong CM,Ying SY.A novel mRN
12、AcDNA interference phenomenon for silencing bcl2 expression in human LNCaP cellsJ. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 281(3)：639644.3 Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, et al. Duplexes of 21 nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cellsJ. Nature, 2001, 411(6836): 494498.4 Al
13、tieri DC. The molecular basis and potential role of survivin in cancer diagnosis and therapyJ. Trends Mol Med，2001, 47(12): 542547.5 Trieb K, Lehner R, Stulnig T, et al. survivin expression in human osteosarcoma is a marker for survivalJ. Eur J Surg Oncol，2003,29(4): 379382.6 Shin S, Sung BJ, Cho Y，et al. An antiapoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of caspase3 and 7 J. Biochemistry，2001, 40(4): 11171123.
