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1、紫外分光光度计的曲线绘制-1-一、测定溶液中物质的含量可见或紫外分光光度法都可用于测定溶液中物质的含量。测定标准溶液（浓度已知的溶液）和未知液（浓度待测定的溶液）的吸光度，进行比较，由于所用吸收池的厚度是一样的。也可以先测出不同浓度的标准液的吸光度，绘制标准曲线，在选定的浓度范围内标准曲线应该是一条直线，然后测定出未知液的吸光度，即可从标准曲线上查到其相对应的浓度。含量测定时所用波长通常要选择被测物质的最大吸收波长，这样做有两个好处：灵敏度大，物质在含量上的稍许变化将引起较大的吸光度差异；可以避免其它物质的干扰。二、用紫外光谱鉴定化合物使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线。方法是用各种波长不同的
2、单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度，然后以波长为横座标，以吸光度为纵座标绘制吸光度波长曲线，此曲线即吸收光谱曲线。各种物质有它自己一定的吸收光谱曲线，因此用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定。当一种未知物质的吸收光谱曲线和某一已知物质的吸收光谱曲线开关一样时，则很可能它们是同一物质。一定物质在不同浓度时，其吸收光谱曲线中，峰值的大小不同，但形状相似，即吸收高峰和低峰的波长是一定不变的。紫外线吸收是由不饱和的结构造成的，含有双键的化合物表现出吸收峰。紫外吸收光谱比较简单，同一种物质的紫外吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同。除了特殊情况外，
3、单独依靠紫外吸收光谱决定一个未知物结构，必须与其它方法配合。紫外吸收光谱分析主要用于已知物质的定量分析和纯度分析。选几个体积梯度，然后稀释成相同的体积，得到了不同浓度 C 的几个标准溶液样组，用紫外分光光度计分别测得相应的吸光度 A1、A2 、A3，然后要以浓度为横坐标，吸光度 A 为纵坐标，绘制曲线。当然有时候根据实际需要，也会有小小的变动。配制标准溶液，用紫外可见分光光度计测量，得到浓度与吸光度的曲线，并且利用线性拟合得到回归方程，直接利用 Origin 的线性拟合功能得到的方程往往截距不等于零，即方程的形式为 y=A+Bx。那是否需要强制令 A=0，再来进行拟合呢？如果 y=A+Bx 这
4、样的形式可以，那么 A 需要多小才是可以接受的？答：如果用样品空白溶液做参比，一般可以设置强制过零点；如果用蒸馏水做参比，一般不能强制过零点。做曲线时一是要带双空白并减去空白 A0, 二是应加 0 回归。减去 A0 是希望消除试验方法固定偏倚对校准曲线的影响，当用校准曲线来估计未知样的浓度时，要考虑到试样的测量吸光度也会受到固定偏倚的影响，如果校准曲线和试样测定过程中出现的偏倚一样，偏倚是无需校正的，可有时两者的操作往往不是同时同批进行的，如由于时间或批次不同，固定偏倚有所变化，那么两者的吸光度就要做不同的校正。即在每批分析时带空白，并对相应的信号进行校正。试验证明加零回归的校准曲线与不加零回
5、归校准曲线比较，两者的 r 和 b值均无差异， 但加零回归校准曲线截距 a 的绝对值明显变小，因此在作校准曲线的回归计算时必须加零回归，使回归线接近原点。紫外分光光度计的曲线绘制-2-截距 a 对低浓度样品计算却影响甚大。尤其是当样品浓度接近空白浓时，用回归方程计算时会出现负值，这是因为校准曲线回归后截距 a空白信号值所致，并非样品中存在产生负值的物质。用回归方程计算结果将引入一个固定的误差，当 a 为正时，计算结果为负误差，当 a 为负时，计算结果为正误差。本来样品的信号值空白信号值，计算出来的结果却为负值，本来不可能检出的，却通过计算被检出了。若将这些截然相反的结果上报将误导数据的后续应用
6、工作。因此应按规定将回归方程中的截距 a 与 0 作 t 检验，当取 95置信水平，经检验无显著性差异时，a 作 0 处理，方程 y=a+bx 简化为 y=bx 后再投入使用，一般情况下 a0.005 和 r0.999 时可不必进行检验，a=处理(3)。回归方程若不经过上述检验和处理而直接投入使用，必将使计算结果引入差值相当于截距a 的系统误差。肉桂醛-苯甲醛双组分体系的紫外光谱特性研究：标准曲线的绘制及检出限分别用空白液配制桂醛标准质量浓度系列0.595mg/L、0.794mg/L、0.99211mg/L、2.013nmg/L、3.005mg/LL、3.997mg/L、4.990mg/L、6
7、.010mg/L、7.003mg/L 和苯甲醛标准质量浓度系列0.998mg/L、1.995mg/L、2.993mg/L、3.997mg/L、5.986mg/L、7.981mg/L、10.026mg/L、12021mg/L.以空白液为参比，于 249nm 和 291nm 处分别测定苯甲醛和桂醛的吸光度.以吸光度为纵坐标，溶液浓度为横坐标，即得标准曲线，如图 3所示.经线性回归，得桂醛回归方程：A=01706x 十 0.004，A 为吸光度，x 为桂醛质量浓度(mg/L)，相关系数 r0.9997，方法的线性范围 0.88mg/L，检出限0.0352mg/L。苯甲醛的回归方程为：A0.1169x
8、+0.0007，x 为桂醛质量浓度紫外分光光度计的曲线绘制-3-(mg/L)，相关系数：=0.9998，方法的线性范围 1-12mg/L，检出限0.0796mg/L。紫外可见分光光度计，先建立标准曲线，大概测多少个样比较准确？还有一般测的时候如何分布浓度会使得结果比较准确呢？答：标准曲线的建立一般选取 5 个以上的浓度水平，浓度选取范围一般在方法规定浓度的 70%130%，但紫外分光光度法还要考虑吸收值在 0.20.6 之间比较好！物质的最大吸收峰是在可见光范围内的。所以想问下 那样的话最好在什么范围比较好呢？而且标准曲线的范围要包括自己以后测样中的浓度才行吧？答：不论是紫外还是可见，吸光度值最好在 0.2-0.8 之间。样品浓度可以稀释。最好是 7 个样，浓度前几个成倍数梯度分布，但是最大值不要太大，吸光度在0.2 到 0.8 之间，这是测样最可信的区域。
