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1、1、 微生物1. 培养基1.1成分培养基的化学成分包括 水、无机盐、碳源、氮源、生长因子1.1.1碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源（自养）；糖类、石油、生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。1.1.2氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。1.1.3培养基还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性，培养细菌是需要
2、将pH调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件1.2 分类1.2.1按照物理性质 可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基确定培养基制作是否合格的方法将未接种的培养基在恒温箱中保温12天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。1.2.2按照用途 可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。鉴别培养基是根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。（如加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌，利用伊红-美蓝培养基鉴别大肠杆菌）1.2.3人工
3、合成培养基和天然培养基1.3 制备牛肉膏蛋白胨培养基1.3.1配方 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂1.3.2操作 计算，称量，融化，灭菌，倒平板称量时，牛肉膏蛋白胨都易吸潮，称量要迅速融化加琼脂时要不断搅拌，防止脂糊底而导致烧杯破裂灭菌时，装有培养基的锥形瓶要用高压蒸汽灭菌法，培养皿要用干热灭菌法平板冷凝后需要倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，防止皿盖上冷凝的水珠落入培养基,造成污染。（微生物培养的时候也需要倒置，另一个原因：由于重力的作用使培养基表面及次层能富集微生物生长所需的营养物质，利于微生物生长。）2 灭菌与消毒2.1消毒 较为温和的理化方法，仅杀死物体表面或内部的部分有害微生
4、物。包括：煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）还有化学药剂消毒（如酒精、氯气、石炭酸等）、紫外线消毒法2.2 强烈理化因素，杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。包括：灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。2.3 灭菌 接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；（防止x的微生物污染培养基） 玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱 ； 培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅 。3 纯化微生物的接种方法3.1平板划线法（适用好氧菌）和稀释涂布平板法（适用好氧菌以及兼性厌氧菌）。3.2平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌
5、种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。3.2.1操作的第一步以、每次划线之前、划线操作结束时均需要灼烧接种环的目的操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。3.2.3在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划
6、线，以免接种环温度太高，杀死菌种3.2.4 最后一区不能与第一区相连，划线力度要适中。3.3稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。3.4用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。4统计菌落数目 4.1测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。4.2释涂布平板法统计（可以区分活死菌）4.2.1为了保证结果准确，一般设置32个平板，选择菌落数在30300的平板进行计数，并取平均值。4.2.2每
7、克样品中的菌落数=（C/V）*M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml），M代表稀释倍数菌种保存斜面保藏 4甘油管藏 204.3显微镜直接计数法统计（不能区分活死菌）利用特定的细菌计数板或者血细胞计数板2 土壤中分解尿素与纤维素的细菌的分离 2.1 原理 2.1.1细菌之所以能分解尿素CO(NH2)2，是因为他们能合成脲酶,将尿素分解为CO2,NH32.1.2土壤中的细菌之所以能分解纤维素，是因为他们能合成纤维素酶，纤维素酶是一种复合酶，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。（棉花是自然
8、界中纤维素含量最高的天然产物）2.2 选择培养基 以尿素为唯一氮源的选择培养基，富含纤维素的选择培养基2.3鉴别方法 2.3.1在培养基中加入酚红指示剂，分解产生氨气，指示剂变红2.3.2在培养基中在含有纤维素的培养基中加入刚果红，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。2、 发酵1. 果酒、果醋1.1发酵：通过微生物技术的培养来生产大量代谢产物的过程。1.1.1 有氧发酵：醋酸发酵 谷氨酸发酵 无氧发酵：酒精发酵 乳酸发酵 1.2 酵母菌是兼性厌氧菌型微生物真菌 酵母菌的生殖方式：出芽生殖
9、(主要) 分裂生殖 孢子生殖1.2.1 在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖。 C6H12O66O26CO26H2O在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。 C6H12O62C2H2OH2CO21.2.2 酒精发酵时一般将温度控制在18-25 1.2.3在葡萄酒自然发酵的过程中,起主要作用的是附着在葡萄皮表面的野生型酵母菌.在发酵过程中,随着酒精浓度的提高,红葡萄皮的色素也进入发酵液,使葡萄酒呈现深红色.在缺氧、呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到制约。1.3醋酸菌是单细胞细菌(原核生物),代谢类型是异养需氧型,生殖方式为二分裂1.3.1当氧气
10、、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。 2C2H2OH4O2CH3COOH6H2O1.3.2控制发酵条件的作用醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。醋酸菌最适生长温度为3035，控制好发酵温度，使发酵时间缩短，又减少杂菌污染的机会。1.4实验流程：挑选葡萄冲洗榨汁酒精发酵果酒（醋酸发酵果醋） 新鲜葡萄除去枝梗，冲洗以除去灰尘为目的，防止洗去野生酵母菌。1.2酒精检验：重铬酸钾。在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。先在试管中加入发酵液2L，再滴入物质的量浓度为3mol/
11、L的H2SO43滴，振荡混匀，最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液3滴，振荡试管，观察颜色1.5实验装置1.5.1充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出二氧化碳的；出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身相连接，其目的是防止空气中微生物的污染。开口向下的目的是有利于二氧化碳的排出。使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应该充气口连接气泵，输入氧/空气。1.5.2葡萄汁装入发酵瓶后要留有1/3的空间，目的时先让酵母菌进行有氧呼吸快速繁殖，耗尽氧气后再进行酒精发酵，防止发酵过程中产生CO2造成发酵液溢出。2. 腐乳2.1参与微生物多种微生物参与了豆
12、腐的发酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一种丝状真菌。代谢类型是异养需氧型。生殖方式是孢子生殖。2.2原理2.2.1毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸。2.2.2毛霉的生长：条件：将豆腐块平放在笼屉内，将笼屉中的控制在1518，并保持一定的湿度。（温度过低不利于毛霉生长，温度高时菌丝易老化死亡，影响腐乳品质）2.2.3来源：1.来自空气中的毛霉孢子 2. 直接接种优良毛霉菌种2.3实验流程：让豆腐上长出毛霉加盐腌制加卤汤装瓶密封腌制2.4实验材料 2.4.1豆腐的含水量为70左右，水分过多则腐乳不易成
13、形；过低，不利于毛霉生长。2.4.2 加盐腌制：将长满毛霉的豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，同时逐层加盐，随着层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。2.4.3 用盐腌制时，注意控制盐的用量（毛胚：食盐5：1）：盐的浓度过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高会影响腐乳的口味2.4.4食盐的作用：1.抑制微生物的生长，避免腐败变质2.析出水分，是豆腐变硬，在后期制作过程中不易酥烂3.调味作用，给腐乳以必要的咸味4.浸提毛酶菌丝上的蛋白酶。2.4.5卤汤：卤汤、香辛料调味、杀菌防腐。卤汤中酒的含量一般控制在12%左右。2.4.6酒的作用：1.防止杂菌污染2.与有机酸
14、结合形成酯，赋予腐乳风味3.酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。2.5防止杂菌污染：用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。装瓶时，操作要迅速小心。整齐地摆放好豆腐、加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。3. 泡菜3.1参与微生物及原理3.1.1 制作泡菜所用微生物是乳酸菌 ，其代谢类型是异养厌氧型。在无氧条件下，降糖分解为乳酸 。分裂方式是二分裂。反应式为：C6H12O62C3H6O3+能量。3.1.2 含抗生素牛奶不能生产酸奶的原因是抗
15、生素杀死乳酸菌。常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。乳酸杆菌常用于生产酸奶。3.1.3 发酵温度在18-20，过高其他杂菌活动能力高，过低不利于乳酸菌代谢。3.2实验材料 3.2.1选用新鲜的蔬菜，若放置时间过长，蔬菜中的亚硝酸盐易被还原为亚硝酸盐。清水与盐的质量比是4：1。盐水要煮沸后冷却，煮沸的作用除去水中的氧气杀灭水中的其他微生物。3.2.2泡菜坛坛盖沿的水槽内注满水，保证乳酸菌发酵所需要的无氧环境。而且，在发酵过程中要经常补水。3.3 发酵中的各类曲线 a. 有氧气，乳酸菌活动受到抑制b. 乳酸菌含量达到最大，抑制其他菌种活性c. 乳酸持续累积，抑制自身活性乳酸菌含量 bc a.有氧气，乳酸菌活动受到抑制a发酵时间（d） 一般在腌制 10 天后亚硝酸盐含量开 始降低，故在10天之后食用最好 pH持续下降10乳酸含量发酵时间（d）3.4测定亚硝酸盐含量在盐酸酸化条件下，亚硝
