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1、第六单元 感染性疾病的免疫学检测,实验一 乙型肝炎病毒表面抗体检测,实验目的,酶联免疫 吸附试验 （ELISA）是 感染性疾病的 常用检验方法,通过乙型肝炎 病毒表面抗体 检测实验， 掌握ELISA的 基本实验 原理及操作步骤,熟悉影响实验结果 的各种因素， 学习正确分析 判断实验结果及 了解检测的 临床意义。,实验原理,采用纯化的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）包被反应板，加入待测标本，同时加入标记了辣根过氧化物酶的HBsAg （HBsAg-HRP），当标本中存在抗HBs时，该抗-HBs与包被的HBsAg结合并与酶结合物结合形成HBsAg-抗-HBs-HBsAg-HRP复合物，加入TMB底物显
2、色，显色的强弱与待测标本中的抗HBs含量成正比。,试剂及器材,包被有HBsAg的微孔板 HBsAg-HRP 阳性、阴性及弱阳性对照血清 显色剂，终止液 酶标仪 洗板机,取出包被好抗原的酶标板,1.加样,标记各孔，加入50L/孔,1,2,3,4,阴性,空白,阳性,待测,2.加酶结合物,3.显色,加入终止溶液1滴/孔，混匀,酶标仪上读取吸光度值,4.测吸光度,实验流程,各孔加入酶标抗原1滴/孔,用洗涤液洗涤5次,37，30min,甩干孔内液体,加入显色液A、B各一滴/孔,37，15min,5,弱阳性,操作步骤,1.将包被孔编号，分别加入标本、阴性对照、阳性对照、弱阳性对照及空白对照各50l 。 2
3、.每孔加入酶结合物1滴（空白对照孔除外），充分混匀，置37孵育 30分钟。 3.甩去孔中液体，加洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复5次后拍干。 4.每孔加显色剂A液、B液各1滴，充分混匀，置37孵育15分钟。 5.每孔加入终止液1滴，混匀。 6.在酶标仪上于450nm波长处读取吸光度值（A），以空白孔校零点，分别测定阴性、阳性、弱阳性对照及样本孔的A450值。,结果判断,样本孔吸光度值（S）/阴性对照孔吸光度值（N）2.1判断为阳性。,实验讨论,ELISA是临床常用的感染性疾病免疫学检测方法，包括间接法、竞争法、捕获法、双抗体夹心法及双抗原夹心法等方法，讨论各种方法的临床应用。 分析ELIS
4、A检测过程中的各种影响因素，探讨本次实验结果的准确性。 讨论乙型肝炎病毒表面抗体检测结果的临床意义。,注意事项,加样应加在板孔的底部，避免加在孔壁上部，避免溅出，避免产生气泡。 洗涤必须彻底，防止产生假阳性。 严格控制温育温度和时间。,实验二 HBsAg不同检测方法的最低检测限 （验证性实验）,实验目的,1.用已知浓度 HBsAg阳性 血清作系列稀 释，分别采用 胶体金免疫层 析法、ELISA 法两种方法将 不同稀释度的 HBsAg进行多 次重复定性检测,2.将所得实验数 据进行分析处理， 以验证不同方法 的最低检测限,3.初步掌握验证 实验的原理、步 骤及注意事项。 熟悉定性检测的 性能验证
5、方法,实验方案,胶体金法,酶免疫技术,乙肝表面抗原的定性检测,最低检测限验证,确定临界值浓度,制备评价用样本,评价方法检测限,判断结果,实验原理（一） 胶体金免疫层析技术,一端粘贴了含有金标记的HBsAg抗体的硝酸纤维素膜试纸条，当其下端浸入血清标本后由于毛细管作用向另一端移动，移动中复溶金标记的HBsAg抗体，若标本中含有HBsAg即可形成金标记抗HBsAg-HBsAg复合物，该复合物移动至测试区时，与固定在载体膜上的HBsAb结合而被固相化并显示红色线条（阳性条带），多余的金标记抗体则越过该区域并与质控区中抗同一种属来源的IgG结合显示红色（质控条带）。,将已知的纯化抗体（HBsAb）吸附
6、于固相载体上加入待检标本（含相应抗原HBsAg）与之结合。洗涤后，加入酶标抗体（HRP-HBsAb）形成夹心，加酶底物溶液显色进行测定。,实验原理（二） 酶免疫技术（ELISA）,双抗体夹心法,实验原理（三）,定值 参比血清 做系列稀 释后重复 检测 确定临界值C50,确定最低 检测限（+20% 样本）,最低检测 限的验证,根据C50制备 评价血清,-20% 样本,+20% 样本,实验试剂及器材,1.实验试剂 HBsAg国家标准物质（浓度为5ng/ml），HBsAg质控血清，HBsAg阴性对照、阳性对照、弱阳性对照血清， 胶体金试剂盒，ELISA试剂盒，MEIA试剂盒。 2.实验器材 酶标仪、
7、洗板机、恒温水浴箱、吸水纸、移液器、微量加样器吸头等。,操作步骤 （一）确定临界值浓度,HBsAg 国家标准 物质(5ng/ ml),不同稀释浓度 重复检测,系列稀释,阴性结果占50%,该浓度即为 临界值C50,阳性结果占50%,记录结果、统计,C5,C50,C95,临界值,表1.不同浓度HBsAg标准物质稀释参照表,（二）胶体金操作方法 顺序将胶体金试纸条浸入血清（不要超过最高检测线）5秒钟后取出，平置，20分钟后判断结果。,（三）ELISA操作步骤 加样 不同稀释度的阳性血清（均做双孔测定）及阴性对照、阳性对照、弱阳性对照血清，分别加入对应的反应孔，留1孔做空白对照，置37 水浴60min
8、。 加酶 每孔加入酶标记抗体50ul,空白对照孔不加，置37水浴30min。 洗涤 甩去各孔内液体，拍干，用洗涤液洗孔6次，每次均拍干。 加酶底物/色原溶液 加显色剂A液、B液每孔各50ul， 37水浴30min显色。 加终止液 每孔50ul。 读数 在酶标仪上于450nm波长处读取吸光度值（A），以空白孔校零点，分别测定阴性对照、阳性对照、弱阳性对照及样本孔的A值。,操作实例：ELISA(双抗体夹心法）,试剂室温平衡,稀释阳性标准物质血清,顺序加样,温育,加酶结合物 温育 洗板,洗板,显色,读取吸光度,判断结果,结果判断,C50是否准确的判断： 根据浓度为C50的样本在40次检测中得到阳性结
9、果的次数判断C50是否准确（表2）。表2,表2 判断C50是否准确,表3.重复检测次数与样本的实际浓度,表4.-20%+20%浓度范围是否包含了C5-C95区间,最低检测限的判断,若-20浓度的样本阴性结果次数和+20浓度的样本阳性结果次数符合表4，,则说明临界值可信，而且+20浓度即为最低检出限。,实验注意事项,加样的准确性：加样及稀释样品时应准确 标准浓度的样品应按浓度顺序加样，及时更换微量加样器吸头防止交叉污染 实验中同时设置阴性、阳性、弱阳性对照和空白对照 洗涤要严格按照要求，彻底洗涤，防止假阳性，但不可冲洗过猛过急导致假阴性 严格控制反应时间和显色时间 胶体金试条法结果应观察30分钟
10、,实验结果分析,两种方法的实验结果进行汇总、统计其阳性及阴性次数，并计算其阳性次数及阴性次数的百分比，以分析确定临界值C50。 在临界值C50的基础上，重复测定并记录+20%浓度样本的检测结果，并计算阳性次数及阳性次数百分比，通过对照表4分析与之是否相符，最终确定+20%是否为可信的最低检测限。,实验小结,总结本实验中两种方法的最低检测限与试剂盒的给定值是否相符。 总结实验过程中的操作是否规范，实验过程中应该注意哪些问题。,实验讨论,基本概念： C50: 是一个临界值，是将阳性标本做系列稀释后，能够获得50%阳性和50%阴性结果的测试物的浓度，要保证C50的重复性较好应保证该临界浓度+20%处
11、于95%的区间内。 C5：指一份样本，在多次重复实验中有95%的几率获得阴性的结果时该分析物得浓度。（低于C50浓度的20%）. C95：指一份样本，在多次重复实验中有95%的几率获得阳性的结果时该分析物得浓度。（高于C50浓度的20%）。,？,实验讨论,重复性验证实验： 重复检测C5、C50、C95样本各40次；确定每一份样本结果为阳性和阴性的百分比；评价其临界浓度是否准确；评价+20% -20%的浓度范围是否包含于这种方法的95%区间。,？,实验三 抗链球菌溶血素O检测,实验目的,1.掌握检测 ASO的原理 和方法、操作 注意事项 及结果的判断 分析,2.了解不同 方法学的优 点与缺点,3
12、.了解ASO 检测不同 方法的临床 应用价值,ASO检测方法,全自动免疫比浊法,乳胶凝集实验,溶血抑制法,定量检测,半定量检测,定性检测,实验原理,一、乳胶凝集实验,实验试剂及器材,实验试剂： 链球菌溶血素“O”，10%乳胶颗粒悬液，阴性、阳性对照血清，pH8.2的甘氨酸缓冲盐水 实验器材： 试管、反应板、旋转摇床、微量移液器、微量加样器、毛细滴管等,操作步骤,致敏乳胶颗粒的制备：用蒸馏水将10%乳胶悬液稀释至1%2%，再将链球菌溶血素“O”溶于pH8.2的甘氨酸缓冲盐水中，逐滴加入稀释的乳剂悬液中(1%乳胶悬液1ml可吸附0.11mg物质），同时摇动使之充分混匀，放置室温3060min，40
13、00r/min离心3045min，弃上清，沉淀用同一甘氨酸缓冲盐水恢复悬浮状态。,操作步骤,稀释血清：将待检血清、阴性血清、阳性血清分别用生理盐水作1:20稀释，备用。 加样：在凝集实验反应板上取三格，用毛细滴管分别加入稀释待检血清、阳性血清、阴性血清各50ul。然后每格加入链球菌溶血素“O”致敏乳胶颗粒试剂1滴。 反应：反应板充分混匀后连续摇动23min后与对照比较，观察结果。,结果判断,“+”全部胶乳凝集，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明。 “+”大部分胶乳凝集，颗粒明显，液体稍浑浊。 “+”约50%胶乳凝集，但颗粒较细，液体较浑浊 “+”有少许凝集，液体呈浑浊。 “-”液滴呈原有的均匀乳状
14、。 出现“+”以上凝集判为阳性。,间接乳胶凝集实验的结果判断,实验注意事项,试剂应充分摇匀。 观察结果应及时，时间过长易造成假阳性。 血清稀释应准确，结果判断应仔细观察。 实验中同时设置阴性、阳性及空白对照 测定ASO浓度较高样品时，应对样品进行稀释后再分析，以保证结果的可靠性。,！,！,！,！,！,全自动速率散射比浊方法,实验原理 可溶性抗原、抗体在液相中结合，形成抗原抗体复合物而出现浊度。当抗体保持中等过量时，形成的复合物随抗原量增加，浊度也相应增加。沿水平轴向反应液照射一定波长的光，当光线通过反应体系时，由于抗原抗体复合物微粒子对光发生折射、反射及透射、使水平方向的光发生偏转而产生散射光
15、。光线偏转的角度与发射光的波长和反应液中抗原抗体复合物的颗粒大小及多少密切相关。 测定单位时间内免疫复合物形成的最快时间段的散射信号值，当抗体量大于抗原量时，形成的免疫复合物为小分子不溶性颗粒，产生的散射信号最强，形成的速率散射信号值也最大，仪器将测得的速率峰值转换为相应的ASO浓度。,试剂及器材,1.全自动速率散射比浊仪 2.待检血清、仪器配套试剂 3.试管、水浴箱、移液器、微量加样器吸头等,操作步骤,1.开机；相关参数设置；校准。 2.处理标本，3500rpm离心l0min，分离血清。 3.输入杯号；选择所测项目ASO；存盘； 4.编程完毕后，将标本放入标本杯中，且放入标本盘中相应位置，将
16、所做项目的试剂放入试剂盘中相位置，确认无误后，开始运行仪器。,结果判断,全自动化散射比浊法： 参考值范围参见不同试剂盒。,实验讨论,乳胶凝集半定量实验及全自动免疫比浊法定量检测的特点？ 试应用所学知识分析影响乳胶凝集试验结果准确性的因素及处理方法?,？,实验四 梅毒螺旋体抗体检测,实验目的,1.掌握临床 常用检测梅毒 感染的方法及 操作程序,3.了解多 种方法联合 检测梅毒 感染的 临床意义,2.熟悉两种 方法的特点,梅毒螺旋体感染的常用检测方法,TRUST （检测非特异抗体）,TPPA(检测特异性抗体）,ELISA (检测特异性抗体）,现症梅毒的主要指标同时是判断治疗效果、复发的指标,特异性强，准确性高，但无法判断是否为现症梅毒,敏感性高，有一定的假阳性率,不同方法具有各自的特点,梅毒感染检测,（一） TRUST实验,实验原理 凝集法-检测
