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1、第三章 酶工程原理及其在食品工业中的应用,王继刚 15872435159,第一节 酶工程原理和方法,（一）酶工程的定义 利用酶、菌体细胞具有的特异催化功能，或对酶结构进行修饰改造，并借助于生物反应器和工艺优化过程，有效地发挥酶的催化特性来生产人类所需产品的技术。它包括酶、细胞固定化技术、酶化学修饰技术和酶反应器设计等。,一、酶工程概述,酶工程是现代生物技术的重要组成部分。 以微生物或酶为催化剂进行物质转化的工业生物技术，大规模生产人类所需的化学品、医药、能源和材料等，是解决人类目前面临的资源、能源及环境危机的有效手段。,酶工程一般工艺流程示意图,胞外酶 胞内酶 菌种基因改造发酵发酵酶液（预处
2、理细胞分离细胞破壁碎片分离）提取精制酶制剂及其改造 酶制剂 原料前处理杀菌酶反应器反应液产品提取成品,（二）酶工程的发展历程 1.20世纪5060年代早期的酶工程技术，主要是从动物、植物和微生物原料中提取、分离、纯化制造各种酶制剂，并将其应用于化工、食品和医药等工业领域。 1949 大规模工业化阶段（液体深层发酵）细菌淀粉酶 2.20世纪70年代后期，酶的固定化技术取得了突破，使固定化酶、固定化细胞、生物反应器与生物传感器等酶工程技术迅速获得应用。 1969 日本固定化氨基酰化酶，第一次将固定化酶成功地应用于工业生产。酶工程诞生,3.目前，各种酶工程技术已用于制造多种精细化工产品和医药产品，并
3、且在食品工业、化学检测和环境保护等各个领域中得到了有效的应用。 酶的非水相催化 新酶的开发,（三）酶的分类： 按酶催化反应的类型分类,1氧化还原酶 2转移酶 3水解酶 4裂合酶 5异构酶 6连接酶（合成酶）,1氧化还原酶 (Oxidoreductase),催化氧化-还原反应，转移氢或加氧。 主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)、过氧化氢酶、氧合酶、细胞色素氧化酶。 如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。,2转移酶(Transferase),转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。 参与生物物质的代谢 例如，
4、谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。,3水解酶(Hydrolase),水解酶催化底物的加水分解反应（或逆反应）。 主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。 例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：,4裂合酶(Lyase),裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。 主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。 例如， 延胡索酸水合酶催化的反应。,5异构酶(Isomerase),此类酶为生物代谢需要对某些物质进行分子异构化，分别进行外消旋、差向异构、顺反异构等，分为差相异构酶、消旋酶、顺反异构酶等,6连接酶（合成酶）(Ligase or Synthetase),合成酶，又称为连接
5、酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。 A + B + ATP + H-O-H =A B + ADP +Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸,酶用于生物催化的概况,国际系统命名法,系统名称包括底物名称、构型、反应性质，最后加一个酶（-ase）字。 酶的系统编号：EC1.1.1.1 例如： 习惯名称:谷丙转氨酶 系统名称:丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶 酶催化的反应: 谷氨酸 + 丙酮酸 -酮戊二酸 + 丙氨酸,工业酶制剂的命名和分类 分类： 碳水化合物酶、蛋白质酶、酯酶和其他酶 如 淀粉酶 高转化率糖化酶
6、（葡萄糖淀粉酶） 一些习惯归类： 1、动物酶、植物酶、微生物酶 2、胞内酶和胞外酶 3、溶液酶和固定化酶,二、酶制剂的生产,1.包括菌种的来源、产酶菌种的分离、筛选、育种和酶的发酵生产等。 2.酶生产菌的要求 （1）不能是致病菌，特别是对食品用酶和医药用酶。目前认为可用于食品工业和医药工业的生产菌种有：枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉、啤酒酵母和脆壁克鲁维酵母。 （2）不易退化，不易感染噬菌体。 （3）产酶量高，而且最好产生胞外酶。 （4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易培养。,3.酶的发酵方法,1、固体培养发酵,培养基以麸皮、米糠等为主要原料加入其它营养成分，经灭菌、接产酶菌株，在一定条件下发酵，目
7、的获得淀粉酶和蛋白酶，如酒曲生产。,2、液体深层发酵,液体培养基，在发酵容器中，经灭菌、冷却接入产酶细胞，在一定条件下发酵，是目前酶生产的主要方法。,3、固定化细胞发酵,三、微生物细胞的破碎,胞外酶：能分泌透过细胞壁到细胞外部的酶。 胞内酶：存在于细胞内部的酶。 对于胞内酶的提取，需要破碎技术，胞外酶则无需破碎。破碎的目的是将细胞壁和细胞膜破坏掉，使胞内物质释放出来，包括机械破碎法和非机械破碎法。,（一）机械破碎法 1.高压匀浆法 适合于细菌和酵母的破碎，不适合于丝状真菌及某些基因工程菌。 2.珠磨法 适合于各种微生物细胞的破碎。 3.超声破碎法 对杆菌的破碎较容易，对酵母菌的破碎效果较差。,
8、（二）非机械破碎法 1.酶溶法 加酶法:常用的有溶菌酶、蛋白酶、糖苷酶等，它们对细胞壁或细胞膜进行酶解，使细胞破碎。 自溶法：在微生物生长代谢过程中，控制一定条件，诱发微生物产生少量的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。 2.化学渗透法 用有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素或金属螯合物等处理，使细胞壁或膜的通透性（渗透性）改变，从而使胞内物质有选择地渗透出来。,四、酶的提取与纯化,酶的提取:在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称作酶的抽提，即初步纯化。常用的方法：盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取、有机溶剂提取。 酶的精制:即高度纯化。常用的
9、方法：沉淀法、超滤法、色谱分离法、结晶法等。其中沉淀法和超滤法既可用于初步纯化，也可用于精制。,分离：将酶从原料中抽提出来，并尽可能少引入杂质，得到粗酶液 纯化：将酶和杂质中分离开来，或者有选择地将酶从包含杂质中分离出来，得到一定纯度的酶。,酶的纯化过程与一般蛋白质纯化过程相比的特点： 1、特定的一种酶在细胞中的含量较少， 2、酶可以通过测定活力的方法加以跟踪。 前者给纯化带来了困难，而后者却迅速找出纯化过程的关键所在。 理想的提取和分离纯化方法：在提高酶的比活的同时，要求酶回收率高，提取步骤少、工艺简单，成本低。,策略： 酶产品的质量要求 设定目标：（用途：医用、食品级、工业级或研究级） 目
10、标酶蛋白与主要杂质的性质 提取过程的设计应尽可能防止酶的损失，减少处理步骤。,提取方法的经济性和可分析性 尽量减少添加剂的使用 尽早使用高效分离方法，将昂贵、费时的分离方法放在最后阶段。 酶活力、蛋白浓度、纯度测定方法可行性 剂型（液体浓缩酶、粉状酶、精制酶、结晶酶等）,基本过程： （一）、材料（选择）预处理及破碎细胞 1.胞内酶和胞外酶 2.破碎细胞 （二）、固液分离（离心或过滤） 酶的溶解性、稳定性,（三）、净化与脱色 絮凝剂 脱色处理 （四）、浓缩 （热量法、沉淀分离、膜分离） （五）纯化、结晶 （干燥）,提取和纯化方法： （一）根据酶分子溶解度不同的方法 通过改变某些条件，使溶液中某种
11、物质的溶解度降低，从溶液中沉淀析出，达到与其他物质分离的目的。 1.盐析沉淀法 通常采用的盐有硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用，因为它在水中的溶解度大而温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。 盐析沉淀所得到的产品常含有大量盐分，一般可用超滤或层析等方法脱盐，使酶进一步纯化。,2.等电点沉淀法 在酶的沉淀分离中，等电点沉淀法经常与盐析沉淀、有机溶剂沉淀和复合沉淀等方法一起使用，使其沉淀完全。 3.有机溶剂沉淀法 利用酶等物质在有机溶剂中的溶解度不同而使其分离。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙酮、甲醇等。 4.复合沉淀法 在酶液中加入某些高分子
12、聚合物，例如，单宁，使它与酶形成复合物而沉淀下来，分离出沉淀后，再用适当方法将酶从复合物中重新析出。,（二）根据酶分子大小和形状不同的方法 1.离心分离法 在酶的提取分离纯化过程中，细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离以及酶的纯化等往往要使用离心分离。,2.体积排阻法 利用具有一定大小网状的凝胶颗粒（固定相）填充柱的分子筛作用，利用溶液中各组分的相对分子质量不同来进行层析分离的一种方法。常用的凝胶有琼脂糖凝胶（Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（Biogel）和葡聚糖凝胶（Sephadex）等。,3.透析 透析膜可用动物膜、羊皮纸、火棉胶或塞璐玢等制成。使用时可做成透析管、透析袋或透析槽等形式。
13、 优点：设备简单，操作简便。 缺点：时间长，若不更换水或缓冲液时，只扩散到膜内外平衡为止。透析结束时，透析袋内的保留液体积较大，浓度较低。 透析主要用于酶、蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化，从中除去小分子物质。透析在酶纯化过程中极为常用，通过透析可以除去酶液中的盐类、有机溶剂、低相对分子质量的抑制剂等。,4.超滤 借助于超滤膜将不同相对分子质量的物质分离的技术，是在一定的正压力或负压力驱动下，将料液强制通过一定孔径的超滤膜，部分小分子的溶质和溶剂透过膜而成为超滤液，而大分子的酶和蛋白质等物质被截留，从而达到分离纯化的目的，也可用于酶液的浓缩和脱色。超滤膜截留的颗粒直径范围为2200nm，相当
14、于相对分子质量1000500000。 构成超滤膜的主要材料有醋酸纤维、尼龙、聚砜、陶瓷等。,（三）根据酶分子电荷性质的方法 1.离子交换层析 根据被分离物质与分离介质（离子交换剂）间异种电荷的静电引力的不同来进行物质分离的。不同离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同，而使不同物质分离。 离子交换剂根据活性基团的性质分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。酶具有两性性质，可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。,2.电泳分离 在外电场作用下，不同蛋白质离子所带净电荷的多少和性质不同，因而其向两极泳动的方向和速度也不相同，从而达到分离的目的。为了减少对流扩散，电泳过程一般在浸透了缓冲
15、液的聚丙烯酰胺凝胶、淀粉胶等介质上进行。电泳分离的蛋白质量通常较小（约数毫克），常用作分析用。但现在已发展了制备电泳，用这种方法制备的酶，可以在介质中洗脱或直接从电泳柱底部依次流出。,3.等电聚焦电泳 先从阳极顶端扩散装入一种酸（如磷酸），然后从阴极端扩散装入一种碱（如乙醇胺），用具有不同等电点的脂肪族聚氨基聚羧基化合物作为两性电介质载体，当阴阳两极通电以后电介质在一定范围内便形成pH值梯度，当该载体电介质同样品一起电泳时，蛋白质便朝其各自等电点相等的pH值位置移动而被浓缩。 优点：不但可将各种酶精确分开，通过测定各段的pH值还可以了解该酶的等电点。可以分离和检出等电点相差仅0.02的两种蛋白
16、质成分。,（四）根据酶分子专一性结合的分离方法 1.亲和层析 酶的底物、底物类似物及酶的竞争性抑制剂同酶之间有着较高的亲和力，可作为配基固定于不溶性载体，可选择性地将酶吸附而同杂质分离。然后可以通过改变缓冲液的离子强度和pH值的方法，也可以使用浓度更高的同一配体溶液或亲和力更强的配体溶液，将酶洗脱下来。 2.免疫吸附层析 利用抗原一抗体的高亲和性反应原理进行酶的分离纯化。,（五）酶分离纯化的原则 1.防止酶失活 这一原则要贯穿纯化工作的始终，在后期尤为重要。 建立一个可靠和快速、易行的测定酶活方法 物理因素、化学因素和生物因素导致酶失活 2.分离纯化的环节的选择（经济、宜行）： 纯化倍数、酶活回收率和重现性 （衡量优劣） 经济、可靠，建立灵敏、快速、特异、精确的检测（酶活和蛋白质的含量）手段。 3、分离步骤、方法和成本间的关系 提取、分离、纯化、制剂,（六）酶的分离纯化应注意的问题 1.
