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1、第四次试验 ELISA法血清抗体检测 免疫胶体金法检测早早孕,免疫学教研室,重点实验(写实验报告）,& 血清抗体的检测： 第一周：免疫小鼠（腹腔注射5%绵羊红细胞SRBC)、EILISA板抗原包被以及封闭 第二周：小鼠眼球取血 分离血清(96h后已经产生特异性抗体，存在血清中） 第四周：ELISA实验检测血清中 抗体水平（ELISA后续步骤）,成绩 课堂表现及出勤情况，占5分 实验报告，占10分 期末考试，占10分,复习第一次课操作,SRBC冻融稀释（得到比例适当的抗原，非完整的红细胞） 每孔加包被液（碳酸盐缓冲液，含抗原）100l, 37 1h （包被） 弃去孔中液体，用PBS洗板3次，每次
2、均拍板 加封闭液，每孔200l，37，30min （封闭） 弃去孔中液体，用PBS洗板3次 ，排干后4度保存,包被和封闭ELISA板（复习）,包被和封闭是ELISA前两个步骤，第一次课已经完成。 包被就是将已知抗原或抗体非特异性，物理性吸附于固相载体表面并保持其免疫学活性。 封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而防止在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。 洗涤：不论是包被还是封闭后，我们都用PBST洗液洗涤三次，目的是去除游离的未结合的物质，从而保证试验结果的特异性及稳定性。,阳性,阳性,阴性,待测一,阴性,待测一,待测二,待测二,1 待测一 本组待测血清样本1:20稀释， 待测二
3、 邻组待测血清样本1:20稀释。 2 1:20稀释 50l待测血清+950l PBS 3 每孔加对应液体（注意混匀）100l，阳性孔和阴性孔分别加入100l的阳性、阴性对照液。加不同液体注意更换枪头，不要串孔。并做好标记 5 统一放入37度孵箱1h（大于1h),ELISA步骤 包被 封闭 加入待测样本 加入酶标二抗 加入底物 加入终止液，终止反应,加入酶（HRP）标记二抗,1 弃液 2 用PBS洗板3次，200l/每孔，每次一分钟以上，水平轻微晃动，切勿串孔、溢出。每次洗完用滤纸拍板，拍干。 3 于8个ELISA孔中加入酶（HRP)标记二抗，100l/每孔。 4 加完后统一放入37度温箱1h(
4、大于1h)。,加入底物-酶促反应-反应终止,1 弃液 2 用PBS洗板7次，200l/每孔，每次一分钟以上，水平轻微晃动，切勿串孔、溢出。每次洗完用滤纸拍板，拍干。 3 于8个ELISA孔中分别加入底物100l/每孔。 4 加完后，室温避光反应10min。 5 反应10min后，于8个ELISA孔中分别加入终止液，50l/每孔。,标记抗体技术,是在抗体球蛋白分子上，连接某一个特定的、容易检测的分子或原子 (标记物)，利用标记抗体能与相应抗原结合的特性，通过标记物的检测，从而确定抗原的存在部位。标记抗体技术目前广泛应用的主要有荧光抗体、酶标记抗体和同位素标记抗体等。此外尚有铁蛋白标记抗体，主要用
5、于免疫电镜的技术，在亚细胞水平上进行抗原定位。,基本类型,放射性核素标记技术 免疫荧光技术 免疫酶技术,1.免疫荧光技术,即免疫荧光细胞组织化学技术，是根据抗原抗体反应的原理，采用荧光素标记的已知抗体作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原，形成的抗原-抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量，以达到对抗原物质定位、定性和定量测定的目的。分为直接法、间接法、补体法、双重免疫荧光染色。,方法,1、直接法：这是最早的方法。其基本原理是用已知的抗体标记上荧光素后成为特异性荧光抗体，染色时将该抗体直接
6、滴在载玻片上进行孵育，使之直接与载玻片上的抗原结合，在荧光显微镜下直接观察，作出判断。该方法评价：简单易行、特异性高、快速方便，常用于肾活检组织几种免疫球蛋白的检测和病原体的检测。但其不足是只能检测相应的一种物质，敏感性较差，效果有时不理想，目前较少作为更多方面的检测。 2、间接法：该法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后，继用间接荧光抗体，与前面的抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧光复合物。在荧光显微镜下，根据复合物的发光情况来确定所检测的抗原。该方法评价：由于结合在抗原抗体复合物上的荧光素抗体增多，发出的荧光亮度强，因而其敏感性强。目前本法应用较广泛，只需制备一种种属荧光抗体，即
7、可适用于多种第一抗体的标记显示。,方法,3补体法：是间接法的改良。它是采用特异性抗体同新鲜补体混合后再与切片上的抗原反应，补体就结合在抗原-抗体复合物上，再用抗补体的荧光抗体与补体结合，形成抗原-抗体-补体-抗补体荧光抗体复合物。这种方法不仅具有间接法的敏感性，而且荧光抗体不受免疫血清的动物种属限制，一种荧光抗体就能检测所有的抗原抗体系统；缺点是较间接法更容易出现非特异性染色，且补体不稳定，每次均要采取新鲜血清，操作上比较麻烦。 4双重免疫荧光染色：即可在同一标本上定位定性检测两种抗原。如A抗原的抗体用荧光素罗丹明标记，呈橘红色，而B抗原的抗体用异硫氰酸荧光素标记呈黄绿色,抗核荧光抗体染色,2
8、.免疫酶标技术,将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种检测术。酶免疫技术按照抗原抗体系统是定位于组织细胞上还是存在于液相样品中分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定技术。,免疫酶组化染色法,直接法：用已知酶标记抗体与组织细胞内相应抗原反应，形成酶标抗体-抗原复合物，加酶使底物显色。此法具有操作简便，特异性强的特点，但一种酶标抗体只能用于检测一种特异性抗原。 间接法则是在酶标记抗体与组织细胞内抗原之间增加抗体反应层次，最后行成抗原-抗体-酶标抗抗体复合物，再通过酶底物显色。对于来源于同一种属动物不同种类的第一抗体，使用一种酶标抗抗体就能完成对不同特异性抗原的检测。,酶免疫测定技术,我
9、们前面讲解的ELISA就是这一技术的应用 亲和素-生物素-过氧化物酶技术，简化ABC技术。亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。生物素又称维生素H，存在于蛋黄中。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。该法敏感性强，非特异着色浅，背景清晰，因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。,3.放射免疫分析,是把放射性核素测定和抗原、抗体间的免疫化学反应两种方法结合起来所形成的一种超微量物质的测定方法。将抗原抗体反应的特异性与同位素测定技术的敏感性相结合的一项新技术，具有特异性强、目前为止灵敏度最高、准确性和精密
10、度好等优点。而且操作简便、易于标准化，其灵敏度较高，可达10-9-10-12g水平,是其他分析方法所无法比拟的。,酶联免疫吸附试验技术（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）（定量、定性实验）,ELISA是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种免疫测定技术，既可以定性也可以定量。主要过程包括将已知抗原(抗体)吸附在固相载体即聚苯乙烯微量滴定板上称为包被，也就是第一次课用绵羊红细胞抗原包被酶标板。这样绵羊红细胞抗原就会吸附在反应孔内壁。通过洗涤，可以将不牢固的抗原洗脱。然后用封闭液（5% BSA/PBS
11、 溶液）将空余的位点占据，以避免后续抗体非特异性吸附。洗涤后加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体，形成已知抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算待测抗体(抗原)的量。洗涤的重要性：抗原,抗体的反应在一种固相载体聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行,每加入一种试剂孵育后,可通过洗涤除去多余的游离反应物,从而保证试验结果的特异性与稳定性。,ELISA优点,敏感性高：可达ng水平 特异性强：将抗原,抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来,可敏感地检测体液中微量的特异性抗体或抗原.。 重复性好：由于其试剂稳定,易保存,操作简便,结果判
12、断较客观等因素,目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域.,ELISA原理,（1） 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性; （2） 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性; （3） 酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果.,常用ELISA方法,1 直接法：检测抗原 A:将待检测抗原吸附在固相载体表面； B:加酶标抗体，形成抗原-抗体-酶
13、复合物； C:加底物。底物的降解量抗原量。 2 间接法 ：检测抗体（本次ELISA方法） A: 将已知抗原吸附于固相载体表面； B: 加待检测抗体，形成抗原抗体复合物； C: 加酶标二抗； D: 加底物。测定底物降解量=抗体量,常用ELISA方法,3 双抗体夹心法：检测抗原 A:将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面； B:加待检抗原，形成抗原-抗体复合物； C:加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物； D:加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体)； E:加底物。底物的降解量抗原量。,；,常用ELISA方法,4 竞争法：测定抗原 A:将抗体吸附在固相载体表面； B:对照孔只加
14、入酶标抗原； C:样品孔加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； D:加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。,各种ELISA原理,竞争法: 标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。,间接法: 利用酶标抗抗体以检测与固相抗原结合的受检抗体,应用,定性、定量检测抗原和抗体水平 间接法ELISA：检测Ab 双抗体夹心法ELISA：检测Ag 竞争法ELISA：检测Ag,注意事项,封闭时注意将封闭液加满各反应孔，并去除各孔中可能产生的贴孔壁气泡。 加洗涤液时，每孔加满，但不要溢出。 加不同样品时更换枪头 每次洗涤液在孔中的停留时间不应少于1 分钟。可水平震荡，增强洗涤效果。 洗涤后板要
15、甩干，不要残留液体。 加终止液后10分钟内测量OD值。,结果分析,阳性对照与阴性对照：阳性对照显色应明显深于阴性对照，否则该实验失败。阴性对照应接近无色，否则反应本底过高，影响反应灵敏度。待测样品：以阴性对照为参考，根据待测孔颜色深浅，将待测样品中特异性抗体浓度标为“-”（无色），“+”（浅色），“+ +”（黄色），“+ + +”（棕黄色）。 本次ELISA采用的是间接法检测抗体，定性检测。,免疫胶体金技术,免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白
16、磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。,常用免疫胶体金技术,（1）免疫胶体金光镜染色法 （2）免疫胶体金电镜染色法 （3）胶体金免疫层析法,胶体金免疫层析法 将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。如检测早早孕,实验报告,实验原理 实验目的 实验相关试剂和器材 实验流程 实验结
