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1、BD FACSCalibur流式细胞仪FACS101 Handbook本课程介绍表面抗原流式分析有关之基础工作原理。如希望进一步了解流式细胞技术应用，请至本公司网站订阅FACSinformation电子报.tw/bdb/index.html。如需要本课程手册，欢迎至本公司网站下载 .tw/bdb/10-5-3-1.html 。如需要免疫荧光染色方法，请至本公司网站下载 .tw/bdb/10-5-4-1.html 。一、BD FACSCalibur基本结构1.1仪器本体：1. 电源开关：在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。2. 光学系统：BD FACSCal
2、ibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射以BD FACSCalibur 基本型为例 FSC Diode 只收488 nm波长散射光 SSC PMT 只收488 nm波长散射光 FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm） FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm） FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 650 nm）3. 仪器面板：仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。流速控制：LO： 样品流速：12 ml /minMED：样品流速：35 ml /minHI: 样品流速：60 ml /min功能控制：
3、 RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。） STANDBY：无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。 PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。PRIME 结束，仪器恢复STANDBY状态。4. 储液箱抽屉：在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。 鞘液筒：位于抽屉左侧，容积4升。装八分满鞘液筒，
4、仪器可以运行大约 3小时。筒上装有液面感应器，鞘液用完时，仪器软件上会有显示。鞘液筒盖上有金属环扣，保证鞘液筒密闭。 废液筒：位于抽屉右侧，容积4升。筒上装有液面感应器，废液盛满时，仪器软件上会有显示。注意废液可能有潜在的生物传染性。 鞘液过滤器：0.22mm过滤器，去除鞘液中的杂质，保证进入流动室的鞘液是干净的。 气路减压阀：沿箭头方向移动阀门开关，鞘液筒减压，气压恢复正常。在鞘液筒添加鞘液时，需要减压。 空气过滤网：用于过滤冷却雷射的空气。5. 上样品区：上样品区是样本管的上样位置。它包括三个部分，一个是进样针 Sample Injection Tube，将样本输入流动室，还有就是支撑架
5、Tube Support Arm、和液滴存留系统 Droplet Containment System。 进样针：是一根不锈钢管，将细胞从样本针中吸入流动室。进样管外有一套管，是液滴保留系统的一部分。 支撑架：用于支撑样本管、并负责启动液滴存留系统。支撑架有三个位置：位于样本管之下的中位，样本管左侧或右侧。液滴存留系统：系统由支撑架、真空帮浦和外套管组成。当支撑架位于左侧或右侧位置时，真空帮浦就会启动，将液体从外管吸入废液筒内。上样时，须注意将支撑架位于中位，以避免过多样品被抽吸到废液筒内（当支撑架位于中位，真空帮浦停止工作）。更换样品时，让仪器保持RUN的模式，使得进样针可以反冲；切换到ST
6、ANDBY模式前，确保液路已冲洗彻底以免碎片沈积到流动室中。1.2 Macintosh计算机与打印机：准备您的细胞样品1. 理想样品浓度调至1-10 X 105 cells/ml？一般实验只需0.5 ml的样品。2. 细胞样品务必放至BD FALCON 352052 试管中，否则无法上机。3. 上机前务必去除样品中之细胞团块，以防止管路堵塞？可使用附滤网BD FALCON试管 (Cat. No.352235) 或35-55 mm的尼龙筛网。4. 供流式分析的样品是单细胞悬浮液，而且大部分样品都需经荧光染色。表面抗原荧光染色的方法大致有两种：直接免疫荧光、间接免疫荧光染色。研究生可至本公司网站下
7、载染色方法 http:/.tw/bdb/10-5-4-1.html 直接免疫荧光染色 Lysed - No - Wash Procedure Lysed - And - Wash Procedure, SimulTEST & HLA-B27 Peripheral Blood Mononuclear Cell Procedure Leukemia and Lymphoma Procedure 1 Leukemia and Lymphoma Procedure 2, B-cell Clonality Assay 间接免疫荧光染色 滴定抗体浓度 常用试剂5. 如因特殊因素无法下载上述实验方法，请e-
8、mail：.tw或 austin_.tw。二、开机、关机标准操作2.1 FACS Calibur 开机1. 开启细胞仪电源。2. 开启其它周边配备电源，如打印机及MO机。3. 开启计算机。4. 确认鞘流液筒有八分满的FACS Flow，确实旋紧 (鞘液筒容量为4L)。5. 将废液倒掉，并在废液筒中加入200 ml 家用漂白水 (废液筒容量为4L)。6. 将减压阀方向调在加压（Pressurize）位置。7. 排除液流管路与过滤器中的气泡。8. 取下样品管，执行 PRIME 功能两次。9. 使用1ml PBS，HIGH RUN 两分钟。10. 可开始分析样品。2.2 FACS Calibur 关
9、机关机前必要动作：清洗进样管和外套管，防止进样管堵塞、或有染料残留。1. 将样品支持架左移，取 2 ml FACSClean（10%Bleach）上样品，让仪器的真空系统抽取约 1 ml 的液体。2. 将样品支持架回正，按 HI RUN，然后让 FACSClean 清洗管路10分钟。3. 按 Standby，取下样品管，执行 PRIME功能两次。4. 取 2 ml dH2O，重复上述步骤1-3。5. 注意最后只留约 1 ml dH2O 在试管中。6. 按 STANDBY 五分钟，使风扇冷却雷射后，关闭细胞仪（必要动作，以保护雷射光源。）7. 倒掉废液，并回填 200 ml漂白水。8. 将减压阀
10、放在VENT 漏气位置。将鞘流液筒充填至八分满。9. 退出软件“File”“Quit”(如有对话选项，选择“Dont save”)。确认退出计算机中所有BD应用软件，所有数据数据已储存备份。10. 关闭计算机。“Special”“Shutdown”。三、上机分析流程建议首次试机避免进行大量试验，仅需准备下列样品。（1）Negative Control（不加任何抗体）。（2）CD3-FITC（FL1 单染）。（3）CD19-PE（FL2 单染）。（4）CD3-FITC /CD19-PE（FL1/FL2 双染）。3.1 Calibur 开机1. 先开启细胞仪本体再打开计算机。 *秘技1：如顺序相反
11、，仪器和计算机之间无法建立正常通讯，无法执行“connect to cytometer”。 解决之道，两者都关机、然后以正确方式重开。2. 向前拉开储液箱抽屉，检查鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，将减压阀方向调在VENT位置（箭头方向）。3. 仪器会对鞘流液筒打气加压，请确认筒盖确实旋紧。 *秘技2：将减压阀方向调在加压（向前）位置。减压阀如在VENT（箭头方向）位置，按RUN功能键时将显示橙黄色（表示仪器不正常，请检查是否失压），正常为绿色显示。3.2开启CellQuest 软件、编辑实验文件4. 在苹果菜单下点击CELLQuest 启动软件。桌面会出现一Untitled 实验文件，可点击
12、实验文件的右上角的放大钮，将实验文件窗口放大。5. 从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。出现散点图对话方框。6. 在出现的散点图对话方框中点击Plot Source，选择Acquisition (收取) ，确认X和Y轴参数预设为FSC-H 1024、SSC-H 1024。在颜色方框中点击Multicolor Gating（收取样品时，门内细胞将出现颜色）。点击OK。此时实验文件会出现FSC/SSC散点图。7. 说明：散点图（Dotplot），又称二维散点图是流式分析最常用图谱，它可以显示两个独立参数的相互关系。在图中，横坐标X轴为为荧光1强度的
13、相对值，单位是道数，纵坐标Y轴则通常表示荧光2或光散射强度的相对值。仪器使用者可因应实验需求来修改所有图谱中显示之参数。第一图X和Y轴参数分别设为FSC-H 1024、SSC-H 1024；第二图X和Y轴参数分别设为FL1-H 1024、FL2-H 1024。修改动作为轻击图谱上X和Y轴参数，并依需要选择之（FSC：细胞大小，SSC：细胞折射率，FL1：FITC绿色荧光，FL2：PE橙色荧光，FL3：PerCP红色荧光）。8. 从屏幕上方Plots菜单中选择Dot Plot功能，可复制一个同样大小的散点图，在出现的对话方框内选择X轴：FL1-H 1024，Y轴：FL2-H 1024。点击OK，
14、FL1/FL2的散点图出现。完成后可将重制图移至原图右方。9. 在工具板中选择四象限工具，在FL1/FL2散点图上拖动Quadrant的中心将它设定在（x，y）（101，101）处，这些象限将指定阴性/阳性区域。建立仪器和计算机之间通讯10. 从Acquire菜单中选择Connect to Cytometer，此时会出现Acquisition Control 对话方框。如果无法选择Connect to Cytometer，参考秘技 #1。如果没见到Acquisition Control 对话，可到屏幕上方Windows菜单中选择Show Acquisition Control。仪器设置文件注意：实验数据质量，取决于最适化仪器设定文件。仪器设定文件不能在数据收取后再更改，研究人员必须在第一次就使用正确的仪器设定文件。仪器设定文件（Instrument settings），含信号器高压（Detector/ Amps），阈值（Threshold），荧光补偿（Compensation）等仪器条件的组合。一般
