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1、细胞培养操作规范,一：细胞培养的基本条件：,1.无菌环境： 细胞培养间消毒 a：使用前紫外照射20-30分钟 b：使用完75%酒精擦拭台面，紫外照射15分钟。 c：每两周用84消毒液擦拭地面、台面一次的方式进行消毒,超净工作台： 使用前 开启柜内紫外灯照射1530分钟 使用时 开启鼓风，在台面内操作 使用完毕后 要用75%酒精将台面和台内四周擦拭干净，紫外照射10分钟。,CO2 培养箱：,1.设定的条件为 37 ， 5 CO2 。 2.使用 CO2 培养箱应注意的问题： 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 保持培养箱内空气干净，定期消毒擦拭。 箱内蒸馏水槽中定期更换灭菌蒸馏水30
2、00毫升，以保持箱内湿度。,控制水盘内污染的方法： 1、 定期(至少每两周一次)，更换水盘内的无菌蒸馏水或无菌去离子水。 2、 在水盘内添加适量硫酸铜，预防真菌污染。配制方法：20g无水硫酸铜5ml浓硫酸1L灭菌纯水。 3、 水盘内添加适量抗生素。 4、定期为培养箱（含水盘）进行一次高温灭菌。,2. 细胞培养条件 细胞培养器皿： 细胞培养瓶： 25平方厘米（加液量3-5ml） 75平方厘米（加液量10-15ml） 150平方厘米（加液量40ml） 细胞培养板：,细胞培养皿 35mm （加液量3ml) 60mm （加液量5ml) 100mm（加液量10ml) 150mm (加液量15ml),常用
3、培养基： RPMI1640： 适合许多种细胞，如肿瘤细胞、正常细胞的原代培养、传代培养等。 尤其适合人白细胞，如H9、HL-60、IM-9和K-562等细胞系的培养。 DMEM： DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高压灭菌】 DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型（4500mg/L）、除菌过滤灭菌】 DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型(1000mg/L)、除菌过滤灭菌】,血清： 常用血清种类：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清 血清的灭活（消除补体活性） 56 ，30 分钟。 使用浓度：5%-20%，一般10% 血清的消毒：过滤除菌 血清解冻步骤：20 或70至4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般
4、用15ml无菌离心管分装。,谷氨酰胺： 谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4放置1周可分解50，故应单独配制，置于-20保存，临用前加入培养液。,消化液： 胰蛋白酶溶液： 常用浓度：0.25%。 消化时间：2-10分钟（显微镜下观察） 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 。,EDTA溶液 使用浓度： 0.02%，与胰蛋白酶配合使用。 EDTA 不能被血清中和，终止消化后，需用培养液或PBS 彻底冲洗培养瓶。,二：细胞培养前准备工作：,1.相关耗材： 细胞培养皿（瓶）若干、离心管（15ml,50ml）、100ml玻璃瓶4个、500ml玻璃瓶4个、2mL冻存管、tip头及枪头盒、吸管（10ml刻度）、吹
5、打管、50ml、10ml、5ml注射器、一次性针孔过滤器（0.22um）、一次性口罩、帽子、手套、纱布、牛皮纸、标签纸,2.相关试剂及配制方法： 细胞培养的相关试剂配制均在超净工作台上操作，严格按照无菌操作流程！ 完全培养基: 基础培养基 90% 血清 10 碳酸氢钠 2.0 g/L 青、链霉素 100Uml 过滤除菌4 保存 使用时加入谷氨酰胺（配制方法：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。,胰蛋白酶-EDTA消化液 称取0.25g的胰蛋白酶和0.02g
6、的EDTA 用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液或D-Hanks配制，用滤器过滤除菌，-20 分装保存。 细胞冻存液配制： 90%血清和10% DMSO,3：常用培养器皿的清洗及消毒 玻璃器皿的清洗 刷洗（自来水）、浸泡（洗衣粉）、冲洗（自来水），烘干（50 ，恒温干燥箱）酸泡 （24小时，至少6小时）、清洗（流水冲洗和蒸溜水冲洗15遍以上），50烘干。 新的橡胶制品洗涤方法 0.5M NaOH煮沸15分钟或浸泡过夜，流水冲洗，0.5M HCl煮沸15分钟或浸泡过夜，流水冲洗，蒸馏水冲洗15次以上，50烤干备用。,消毒： 消毒前常用的包装：牛皮纸、棉布、铝饭盒包装 高压蒸汽消毒：121 ，维持
7、20-30分钟。,三：细胞培养方法,1.细胞复苏方法： 从 液 氮 中 取 出 冷 冻 管 ， 迅 速 投 入 37 水浴中，甩动冻存管，使其融化（1分钟左右）； 5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上； 1000转低速离心5分钟； 去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,2.细胞换液方法： 换液指针： 观察培养基颜色：当培养基的颜色由红色渐渐褪成橙黄色，颜色清亮，无杂质，无浑浊 观察细胞生长状态：细胞生长状态良好，确认无细菌真菌污染 换液方法： 将吸管、废液缸放入工作台开启细胞培养房及工作台紫外消毒20分钟， 开启恒温水浴箱，培养液预热 关闭紫外灯，开启工作台上风机 吸弃原培养液 加入新的
8、培养,3.细胞传代方法： 传代指针： 观察培养基颜色：当培养基的颜色由红色渐渐褪成橙黄色，颜色清亮，无杂质，无浑浊 显微镜观察细胞生长状态：细胞生长状态良好，铺满培养瓶80%以上，细胞透亮，形态清晰，间隙无杂质，确认无细菌真菌污染,传代方法： 将新的培养皿、吸管、废液缸放入工作台开启细胞培养房及工作台紫外消毒20分钟， 开启恒温水浴箱，培养液、消化液预热 关毕紫外灯，开灯，通气，点燃酒精灯 吸弃培养基，PBS清洗两次 加入2ml消化液晃动培养瓶使消化液覆盖整个细胞界面后吸弃培养液 肉眼观察细胞培养瓶底部出现一层云雾状，轻轻敲打底部有块状物脱落，显微镜下观察看到细胞间隙变大，细胞回缩变圆少量漂浮
9、后加入10ml含血清培养基终止消化，吹打管吹打数次 将细胞悬液吸至离心管，1000rpm离心5分钟 吸弃上清，加入PBS吹打混匀， 1000rpm再次离心5分钟 吸弃上清，加入新鲜培养基，吹打混匀，按比例接种到细胞培养瓶,细胞消化时间的控制：,4:细胞冻存： 吸出旧培养液加PBS冲洗两次 胰酶消化 加培养基中止消化，（以上步骤同细胞传代） 细胞计数 离心收集细胞，吸弃上清，加入冻存液调整细胞密度至1106个/ml 将细胞移入冻存管，写好标签（细胞种类，冻存时间）4 15-30分钟，-20 1-2小时，-80 保存，或过夜后至液氮罐内保存。,5:细胞计数,细胞计数板计数室构造,数红色边框标记的四
10、个方格内的细胞总数（如有压线则计上不计下，计左不计右） 细胞数/ml=（4个大方格细胞总数/4）104稀释倍数,四、细胞培养注意事项,1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射20-30分钟灭菌，以75 %酒精 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。 每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以75 %酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作,2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。容器、培养瓶、培养板和培养皿实验用品以75 % 酒精 擦拭外部后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。切记开启鼓风。 3、 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝下放置桌面。,4.一次将所有的所需要试剂、工具放入工作台。不要半路走出工作间拿东西，传递东西进工作室需酒精擦拭灭菌,
