第四章 免疫分析技术

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1、第四章 免疫分析技术,主要内容,第一节 免疫检测技术概述 第二节 四种常见免疫分析技术 第三节 免疫生物传感器 第四节 免疫胶体金标记技术 第五节 免疫亲和色谱 第六节 免疫印迹技术,第一节 免疫检测技术概述,免疫检测技术起源：检测病原微生物抗原及抗体的血清学诊断。 1896年G. Widal和A. Sicard利用伤寒病人的血清与伤寒杆菌发生特异性凝集的现象，有效准确地诊断伤寒。 免疫分析法（immunoassay, IA）是利用抗原抗体反应产生免疫复合物的原理分析微量或超微量待测物质的一种分析手段，往往需要借助一种信号放大系统把抗原抗体结合的反应信息予以展现和放大。 免疫分析技术是以抗原与

2、抗体在体外特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术。 免疫分析法是将免疫反应与现代测试手段相结合而建立的超微量测定技术。,免疫分析技术的特点,高度的灵敏性：可检测10-1810-6级别的物质；（免疫聚合酶链反应，免疫沉淀反应） 高度的特异性：可区别物质间细微的差异，这是其他技术无法比拟的。,样品前处理复杂 操作繁琐 需要昂贵的仪器设备 检测时间长,可大大简化甚至省去复杂的样品前处理过程 操作简便 无需昂贵的仪器设备 快速、灵敏、特异，可短时间检测大量样品,与目前农药残留的主要检测方法气相色谱分析法和高效液相色谱法等相比，免疫分析方法具有明显优势。,GC/HPLC法 IA分析法,免疫分析技术的分类

3、,根据免疫反应的动力学类型分为： 竞争反应：标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）共同竞争与抗体的反应。 Ag（样品） + Ab AgAb Ag *（定量加入） + Ab *AgAb 夹心反应：将抗体、抗原和第二抗体结合在一起，形成夹心式结合物。最终，检测夹心结合物上标记物，计算样品中抗原含量。 Ab1 + Ag + Ab2* Ab1-Ag-Ab1*,免疫分析技术的分类,根据抗原和抗体在反应中存在方式不同分为： 均相分析（液相免疫分析）：不需要将游离抗原与结合物分离，直接进行测定。特点：简单省时，适合于测定小分子化合物，灵敏度10-9 g/ml； 异相分析（固相免疫分析）：抗原抗体反应后，将结

4、合物与游离抗原（或抗体）及样品用常规物理方法分离，然后对分离出的结合物进行检测。特点：有较高灵敏度灵敏度10-12 g/ml，干扰少。,免疫分析技术的分类,根据标记方法的不同分为： 荧光免疫分析技术 放射免疫分析技术 酶联免疫分析技术 发光免疫分析技术 免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学、生物发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应，并借助荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接进行观察或进行自动化测定。,第二节 四种常见免疫分析技术,（1）荧光免疫分析技术,荧光免疫分析技术是标记免疫技术中发展最早的一种，

5、是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性结合起来的一种方法。 1941年，Coons首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术。 基本原理：荧光免疫分析法是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。,（1）荧光免疫分析技术,荧光现象与荧光物质 荧光素(fluorescein): 在蓝光或紫外线照射下，发出绿色荧光的一种黄色染料。用于荧光抗体技术中的荧光染料。 常用的荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC），四乙基罗丹明（RB200），四甲基异硫氰酸罗丹明（

6、TRITC），酶作用后产生荧光的物质。,（1）荧光免疫分析技术,抗体的荧光素标记 用于标记的抗体要求：高特异性和高亲和力；不应含有针对标本中正常组织的抗体；一般需经纯化提取后再作标记。 作为标记的荧光素要求：具有能与Ab分子形成共价健的化学基团；与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率；荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明；与Ab结合后不影响Ab的生化与免疫性质；标记方法简单、安全无毒；与蛋白质的结合物稳定，不易解离，易于保存。,（1）荧光免疫分析技术,直接法 优点：操作简便、特异性高、非特异 荧光染色因素少， 缺点：灵敏度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体,（1）荧光免疫分析技术,间接法

7、 优点：灵敏度高，在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。 应用：常用于微生物检测，例如：沙门氏菌。,在医学检验中的应用:荧光抗体技术在临床检验上已广泛用于细菌、病毒和寄生虫的检验及自身免疫病的诊断等,荧光显微镜,（2）放射免疫分析技术,放射免疫分析技术（Radioimmunoassay，RIA） 定义：是以放射性核素为标记物的标记免疫分析方法，用于定量测定受检标本中抗原。 1959年，Yalow和Berson创建的分析方法。 基本原理：,（2）放射免疫分析技术,常用标记核素： 125I： 射线，半衰期 60 天 3H： 射线，半衰期 12.3 年 测量仪器 计数仪

8、 液闪仪 优点： 检测灵敏度高，高达ngpg水平; 测定的准确性好，数量级的回收率接近100%. 缺点： 操作相对复杂， 同位素半衰期短，保存及操作相对复杂。,液闪仪,计数器,（3）酶联免疫分析技术,继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后发展起来的一大新型的标记免疫技术，这一技术的诞生被誉为免疫血清学技术的一场革命，是应用最广泛的免疫学技术之一。 1971年，Engvall和Perlman首次报道建立酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays, ELISA）。 由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。,（3）

9、酶联免疫分析技术,基本原理：利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高特异性抗原-抗体免疫学反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。 常用于标记抗体的酶： 酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。 目前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。,（3）酶联免疫分析技术,直接法测定抗体 缺点：每检查一种抗体需制备相应的特异抗体。,（3）酶联免疫分析技术,间接法测定抗体 优点：灵敏度高，在不同抗体的检测中只需应用一种酶标抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。,（3）酶联免疫分析技术,双抗体夹心测定抗原,（3）酶联免疫分

10、析技术,应用：检测食品中农、兽药残留及微生物；还可以检测营养素，例如蛋白质、激素等。,酶标仪,（4）发光免疫分析技术,发光免疫分析：将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。 发光:是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。 根据形成激发态分子的能量来源不同可分为:光照发光、生物发光、化学发光等。,（4）发光免疫分析技术,化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)：将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种

11、抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。 是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 常用化学发光剂有直接化学发光剂和酶促反应发光剂。 直接化学发光剂：吖啶酯，三联吡啶钌 酶促反应发光剂：鲁米诺及其衍生物，AMPPD,（4）发光免疫分析技术,化学发光免疫技术基本原理：用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管

12、将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。,辣根过氧化物酶标记化学发光-直接竞争法,辣根过氧化物酶标记化学发光-双抗体夹心法,几种标记免疫分析技术比较,第三节 免疫生物传感器,免疫生物传感器（immune-biosensor）是生物技术与微电子技术结合，利用生物体内抗原、抗体转移性结合而导致电化学变化的设备装置。 免疫传感器分为两类： 利用竞争酶免疫反应原理设计： 例如：黄曲霉毒素传感器：氧化极和黄曲霉抗体膜组成 检测农、兽残留，微生物等 利用亲和性设计： 例如：农兽药品种 检测食品添加剂、营养素（氨基酸、脂肪酸和糖类）以及农兽药等污染物。,免疫生物

13、传感器原理示意图,第四节 免疫胶体金标记技术,胶体金（colloidalgold）是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。 胶体金颗粒由一个基础金核及包围在外的双例子层构成，紧连在金核（Au）表面的是内层负离子（AuCl2-），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。 免疫金：胶体金可与免疫活性物质（抗体或抗原）结合形成胶体金结合物，常称为免疫金复合物（肉眼可见的红色）。,第四节 免疫胶体金标记技术,检测原理 ：以胶体金作为示踪标记物，以微孔滤膜为固相载体，包被已知抗原或抗体，加入待测样品后，经滤膜毛细管作用，使标本中的抗原或抗体与膜上包被的抗体或抗原结合，胶体

14、金结合物大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，用于定性或半定量的快速免疫检测。,检测结果,以血吸虫抗体检测试纸条为例,第五节 免疫亲和色谱,免疫亲和色谱（Immmuno affinity chromatography, IAC）是以抗原抗体的特异性、可逆性免疫结合反应为原理的色谱技术。 特点：特异性强，结合容量大，洗脱条件温和，色谱柱可以方便地再生使用 应用：作为免疫净化柱，适用于复杂样本中痕量农兽药残留的分离分析。 步骤：加样洗涤洗脱 详见下图,免疫亲和色谱柱示意图,第六节 免疫印迹技术,免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，是一种借助特

15、异性抗体鉴定抗原的有效方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。 将含有目标蛋白(抗原)的样品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或非变性电泳(Native-PAGE)等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。,举例,例如，将经SDS-PAGE分离的蛋白质带转移到膜上后，膜用封闭液处理，然后与第一抗体反应，膜经漂洗后再与偶有辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸(酯)酶(AP)的第二抗体反应，加人生色底物反应之后，即可显示出目标蛋白的位置。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，其优点是方法简便、标本可长期保存、结果便于比较，故广泛应用于分子生物学等领域，成为免疫学、微生物学及其他生命科学常用的一种研究方法。,