分解纤维素的细菌的分离

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1、专题二 微生物的培养与应用,课题3 分解纤维素的微生物的分离,纤维素与纤维素酶,1.纤维素,纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。,一、基础知识,清除肠道内毒素物质，将各种毒素吸附、稀释、包裹，并促进其迅速排除体外，有肠道清道夫的美称。 平衡膳食结构 促进胃肠吸收水份，延缓葡萄糖的吸收，改善耐糖量，是糖尿病人的理想食品。,谁需要纤维素,日常饮食中全谷类食物、新鲜蔬菜、水果不足者； 希望增加膳食纤维摄取者,特 别 适 合 人 群,中老年： 易患高血压、便秘 爱美人士： 帮助控制体重，保持最佳身材 糖尿病、冠心病、高血脂症的预防,阅读课本27页基础知识部分第一、

2、二段，回答下列问题：,1. 纤维素在生物圈的分布状况？,纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质。植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。,一、纤维素和纤维素酶,思考：纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨，但却不会在地球上大量的积累，为什么？,纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。,纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。,2.纤维素酶的组成及作用？,3、纤维素的分解,

3、能分解纤维素的微生物有各种细菌、真菌和少数放线菌。,方法：滤纸崩溃法,4、纤维素酶活性的测定实验：,取二支20mL的试管,纤维素酶分解纤维素的实验,各加入一张滤纸条,各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液11ml和10ml,甲 乙,在乙试管中加入1mL纤维素酶,两支试管固定在锥形瓶中，放在 140r/min的摇床上振荡1h,结果：乙试管的滤纸条消失,讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？,本实验的自变量是纤维素酶的有无，自变量的操纵方法是：在一支试管中添加适量（1mL）的纤维素酶溶液，在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会

4、影响溶液的pH。,实验分析：P27的小实验是如何构成对照的？,下列生物能分解纤维素的是（ ） 人 兔 牛 蘑菇 纤维杆菌,A、 B、,C、 D、,C,刚果红染色法,刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。,（二）纤维素分解菌的筛选,当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，这样我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。,练一练：,1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是 ( ),A. 纤维素酶是一种复合酶，至少

5、包括三种 B. 纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖 C. 纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁 D. 葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖,D,2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是( ),A. 刚果红能与纤维素形成红色复合物 B. 刚果红能与纤维二糖形成红色复合物 C. 刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物 D. 若培养基上产生了透明圈，则说明已筛 选出了纤维素分解菌,B,二、实 验 设 计,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,挑选产生透明圈的菌落,思考：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？,本实验流程与课题2的流程的区别如下:课题2是将土样制成的菌

6、悬液直接涂布在以尿素为惟一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。,土壤取样,取样环境,富含纤维素的环境中,由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。,原因,土壤取样,实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。,讨论:如果找不到合适的环境，可将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应埋进土壤中多深？,将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。

7、一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。,2、选择培养,增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。,目的：,说明：分析“纤维素分解菌的选择培养基配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。,培养基成分分析,参照课本29页旁栏中的比例配置，回答下列问题:,a.旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？,b.这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？,是液体培养基，原因是配方中无凝固剂,有选择作用，本配方中的碳源是纤维素，所以能

8、分解纤维素的微生物可以大量繁殖,2.制备选择培养基,提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基,可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,c.你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？,称取土样20 g，在无菌条件下加入装有30 mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30 下振荡培养12 d，至培养基变混浊。吸取一定的培养液（约5 mL），转移至另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变浑浊。,操作：,2、选择培养,思考：为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？,在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制

9、，因此可以起到“浓缩”的作用,梯度稀释,按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数到106,将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,1. 制备培养基: 参照旁栏中的比例 2. 涂布平板： 将稀释度为104106的菌悬液各取0.1ml涂布在培养基上，30倒置培养,挑选产生透明圈的菌落,挑取产生明显的透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。 接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C 370C培养，可获得纯培养。,5.刚果红染色法 方法一：先 ，再加入刚果红,进行颜色反应。 方法二：在 时就加入刚果红。,培养微生物,倒平板,思考：这两种方法各有哪些优点与不足？,这两

10、种方法各有哪些优点与不足？,颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用,操作繁琐 刚果红会使菌落之间发生混杂,操作简便,不存在菌落混杂问题,1.产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈 2.有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。,P29旁栏思考题,方法一中NaCl溶液的作用？,思考：,漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强

11、！,1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。,四、结果分析与评价,2.分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。,四、结果分析与评价,为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_实验，纤维素酶的发酵方法有_ 发酵和_ 发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的_ 含量进行定量测定。,发酵产纤维素酶,液体,固体,葡萄

12、糖,五、课题延伸,分解纤维素的微生物的分离,纤维素酶,种类、作用、催化活力,刚果红染色,筛选原理,实验设计,土壤取样,选择培养,涂布培养,纯化培养,前置染色法 后置染色法,富含纤维素土壤,增大分解菌含量,染色鉴别,分离出分解菌,课堂总结,1.在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列哪一生物学观点( ) A.生物结构与功能相适应的观点 B.生物结构与功能整体性观点 C.生物与环境相适应的观点 D.生物发展进化的观点,练一练：,C,2.从土壤中分离获得某种微生物的步骤是( ) 土壤取样 梯度稀释 选择培养 菌悬液涂布平板 挑选出单个菌落 A. B. C. D.,B,3. 有关选择培养正确的叙

13、述是( ),A. 可以增加纤维素分解菌的浓度 B. 可以减少纤维素分解菌的浓度 C. 所用培养基是固体培养基 D. 所用培养基是平板培养基,A,4.下列关于纤维素酶的说法，错误的是 （ ） A. 纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种 B. 纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖 C. 纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁 D. 葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖,D,5.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是（ ） A. 刚果红能与纤维素形成红色复合物 B. 刚果红能与纤维二糖形成红色复合物 C. 刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物 D. 若培养基上产生了透明圈，则说明已筛 选出了纤维素分解菌,B,

14、D,6.纤维素分解菌的选择培养基有选择作用，原因在于其含有 ( ) ANaNO3 BKCl C酵母膏 D纤维素粉,7.刚果红染色时，加入刚果红可在( ) 制备培养基时 梯度稀释时 倒平板时 涂布时 培养基上长出菌落时 A B C D,C,8分离纤维素分解菌的实验过程中操作有误的是( ) A经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 B富集培养这一步可省略，但培养纤维素分解菌少 C经稀释培养后，用刚果红染色 D对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上,A,解析：经选择培养后，再经稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上；富集培养可省略；经稀释培养后，用刚果红染色；设置对

15、照能证明经富集培养的确得到了欲分离的微生物.,9下图为分离并统计分解纤维素的微生物的实验流程，据此回答有关问题： (1)要从富含纤维素的环境中分离纤维素分解菌，从高温热泉中寻找耐热菌，这说明_。,根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,(2)某同学根据需要，配制了纤维素分解菌的培养基如下，整个实验过程严格执行无菌操作。 如果将其中的纤维素粉换成_，菌落数_，即可说明选择培养基的作用。,葡萄糖,明显多于选择培养基上的菌落数,(3)接种微生物最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，本实验宜采用_ 法， 原因是_。,稀释涂布平板,平板划线法难以根据稀释体积计算每克样品中的细菌数,【解析】 (1)因为纤维素分解菌与耐热菌有不同的生活习性，生活在不同的环境中，故要根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。(2)因为葡萄糖是纤维素水解的、能被微生物直接利用的有机小分子，所以如果将其中的纤维素粉换成葡萄糖，纤维素分解菌及其他细菌会生长繁殖得更快，故菌落数明显多于选择培养基。(3)因为稀释