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1、从几种真菌中提取几丁质和壳聚糖的研究 彭益强 ? 徐锦海? 高超 ? 李静丽 ? 贺淹才 ( 华侨大学化工学院 ? 泉州? 362011) 摘? 要? 采用电解法从培养的几种真菌湿菌体中制取几丁质; 采用碱提取法从培养 的几种真菌湿菌体中制取壳聚糖, 用红外光谱分析仪测定其特征曲线, 同 标准曲线比较, 确定提取物是壳聚糖产品。比较几种真菌的产品提取率, 黑曲霉的几丁质、 壳聚糖提取率最高, 分别为 20?8% 、 12?1% 。比较几种 真菌的产品质量指标, 黑曲霉最为理想。 关键词? 黑曲霉? 猴头菇? 平菇? 几丁质? 壳聚糖? 游离胺基 ? ? 几丁质( chitin) 又名甲壳素,
2、广泛存在真菌、 甲 壳类动物中。几丁质脱乙酰基就转变为壳聚糖。两 者在医药卫生、 工农业、 造纸、 印染、 环保、 化妆品、 食 品等各领域有着广泛的应用。目前工业生产几丁质 和壳聚糖所用的原料主要是甲壳动物的外壳。对以 微生物为来源获取几丁质和壳聚糖的方法也展开了 研究。比较常用的微生物是真菌菌体。但哪种( 哪 些) 真菌菌体较适合用于几丁质和壳聚糖的提取, 提 取工艺如何, 还未见有人比较过。本研究以黑曲霉、 猴头菇、 平菇这些真菌为材料, 比较它们的发酵条 件、 产量、 提取率和质量。以此说明各个真菌在提取 几丁质和壳聚糖中的各自特点。这样在生产中就可 根据实地情况有针对性的选择。 1?
3、 材料与方法 1?1? 菌种 黑曲霉( Aspergillus niger) 由厦大微生物教研室 提供 猴头菇( Hericium ernaceus) 平菇( Pleurotus ostreatus) 1?2? 培养基 黑曲霉 ? YEPD 培养基: 葡萄糖 2% 、 蛋白胨 2%、 酵母浸出膏 1%、 PH 6?0 猴头菇? 配方 1 ? 麦麸培养基: 麦麸 5% ( 煮沸 30min 后 过 滤 取 滤 液) 、C6H12O615%、蛋 白 胨 0?2% 、 KH2PO40?03%、 MgSO4?7H2O 0?02%、 VB1 微量、 PH 自然 ? ? 配方 2 ? 葡萄糖培养基: 葡萄
4、糖 3% 、 蛋白胨 0?5%、 NaCl 0?1% 、 KH2PO40?03%、 MgSO4?7H2O 0. 02%、 玉米粉 3% ( 煮沸 30min 后过滤取滤液) 、 VB1微量、 PH 自然 ? ? 配方 3 ? 玉米粉培养基: 玉米粉 3% ( 煮沸 30min 后过滤取滤液) 、 葡萄糖 1%、 蛋白胨 0?5%、 NaCl 0?1% 、 KH2PO40?03% 、 MgSO4? 7H2O 0. 02% 、 VB1微量、 PH 自然 平菇 ? 配方 1? 蔗糖 1%、 废糖蜜 2% 、 蛋白胨 0?3%、 KH2PO40?03% 、 MgSO4?7H2O 0. 02% VB1
5、微量、 PH 自然 ? ? 配方 2? 玉米粉 3% 、 蔗糖1%、 KH2PO40?3%、 MgSO4?7H2O 0?15% 、 PH 自然 1?3 ? 培养条件 将三种斜面菌种用无菌水制成孢子悬浮液, 显 微镜下观察, 控制在 1 106- 3 106个孢子/ ml, 在 250ml 三角锥瓶中装入 100ml 培养液, 接入 2ml 孢 子悬浮液。于 30! 摇床培养。每隔 6h 取样测菌体 干重和培养液残糖。测菌体干重: 用滤菌器抽滤, 菌 体洗涤至中性, 60 ! - 70! 干燥 24h 至恒重, 称量。 测培养液残糖: 采用上清液还原糖的测定 DNS 7 法。测培养液残蛋白: 考
6、马斯亮蓝法。 1?4 ? 几丁质的制备 黑曲霉 ? 电解法: 本实验参考文献 1改进, 电 压 30V, 相对电流强度 15mA。反应液为 2% 的 NaOH 溶液。绝缘板上铺支持介质( 普通滤纸) , 用 ?10?福建化工 ? ? 2000 年 ? ? 第 4 期 反应液滤湿。在滤纸上铺一层匀浆破碎的黑曲霉湿 菌体。反应时间 4h- 22h( 视菌体多少而定) 。把电 解后的固体物质洗涤并干燥。 猴头菇 方法 1? 电解法: 同上 方法 2 2? 猴头菇菌丝体 清水漂至无色过滤压榨 净化菌丝体 12% NaOH 回流加热 2h 过滤 黄色胶状物 2% KMnO4水洗压榨 ? 2. 5%HCl
7、加热至沸 0?5h 水乙醇乙醚淋洗干燥 精制几丁质 ? ? 平菇 ? 电解法: 同上 1?5? 碱法制备壳聚糖 匀浆破碎的菌丝体经 5% NaOH 溶液 100! 处 理6h( 采用冷凝回流装置) 。用玻璃滤菌器抽滤洗 涤至上清液无色。用 45% NaOH 溶液 126! 处理 2h- 3h( 灭菌锅内进行, 压力保持 0?15MPa) 。洗涤 至沉淀物为中性后, 用 10%醋酸, 95 ! - 100! 处理 3h, 共抽提 2 次。离心后得 到的醋酸抽提液用 NaOH 溶液调 pH10, 可以看到出现白色絮状物即壳 聚糖, 抽滤洗涤, 60! - 70! 干燥。 1?6 ? 壳聚糖定性鉴定
8、 利用红外光谱分析仪, 测定三种提取物的特征 吸收曲线。比较它们的特征吸收峰与标准壳聚糖的 特征吸收峰。 1?7 ? 壳聚糖部份质量指标的测定 ( 1) 脱乙酰度测定? 参考文献3 ( 2) 粘度与水分的测定? 参考文献4 ( 3) 分子量的测定? 参考文献1 ( 4) 产品得率= 得到的壳聚糖重量 提取前干菌体重量 100% 2? 结果 2?1 ? 菌体产量 根据实验记录数据, 黑曲霉产量最大, 48h 最终 培养量平均每 100ml 培养干菌体 0?952g; 猴头菇配 方 3, 52h 最终培养量平均每 100ml 培养干菌体 0?71g; 平菇配方2, 54h 最终培养量平均每 100
9、ml 培 养干菌体 0?53g( 均取几种配方中结果最好的) 。生 长量曲线如图 1 所示: 图 1? 几种真菌培养量曲线 2?2? 残糖浓度 根据实验记录数据, 黑曲霉培养液 36h 后, 残糖 浓度下降 86% , 42h 后残糖浓度为 0?624mg/ ml, 以 后基本不变。猴头菇培养液 3、 平菇培养液 2( 均取 几种配方中结果最好的) , 36h 后残糖浓度下降仅 40% 和 30% 。49h 后猴头菇培养液 3残糖浓度才基 本不变, 51h 后平菇培养液 2 残糖浓度才基本不变 ( 图 2) 。对比菌体生长量曲线, 可见残糖浓度变化 和菌体生长量有一定对应关系。 ?11?福建化
10、工 ? ? 2000 年 ? ? 第 4 期 图 2? 培养液残糖浓度曲线 2?3? 残蛋白浓度 根据实验记录数据, 三种菌体培养液的残蛋白 浓度变化规律与残糖的相似。 2?4? 壳聚糖红外光谱鉴定图 比较三种菌体提取物的红外光谱吸收曲线, 可 以发现它们的特征吸收峰与标准的壳聚糖特征吸收 峰基本一致, 由此可以确定从三种菌丝体中提取的 产品确实是壳聚糖。 提取物红外光谱图与标准产品红外光谱图比较 见图 3 6。 图 3? 从虾壳中提取的壳聚糖红外光谱图 ?12?福建化工 ? ? 2000 年 ? ? 第 4 期 图 4? 黑曲霉提取物红外光谱图 图 5? 平菇提取物红外光谱图 ?13?福建化
11、工 ? ? 2000 年 ? ? 第 4 期 ? ? ? ? 图 6? 猴头菇提取物红外光谱图 2?5? 几丁质得率 本实验黑曲霉提取的几丁质外观为白色半透明 片状固体, 得率为 20?6%。猴头菇提取的几丁质为 灰色半透明片状固体, 得率为 13?2% 。平菇提取的 几丁质外观为暗灰色不透 明片状固体, 得率为 11?4%。 2?6? 壳聚糖部分质量指标 黑曲霉 ? 游离胺基 93?76% ? 粘均分子量 M8?275 104 ? ? ? ? 水分 9?16% ? ? ?得率 12?10% 猴头菇 ? 游离胺基 74?43% ? 粘均分子量 M7?816 104 ? ? ? ? 水分 9?0
12、9% ? ? ?得率 4?81% 平 ? 菇 ? 游离胺基 77?5% ?粘均分子量 M7?858 104 ? ? ? ? 水分 12?4% ? ? ?得率 8?41% 3? 讨论 真菌细胞壁富含几丁质( 有的还直接含壳聚糖) 和蛋白质, 并且较易培养, 来源稳定, 做为生产几丁 质和壳聚糖的原材料具有巨大的优势。实验结果表 明黑曲霉的产量最高, 提取率也最大, 是一个值得重 点发展的菌种。猴头菇、 平菇的产量尚可且培养基 配方较简单, 成本较低。 蛋白质具有可电离的基团, 在溶液中能形成带 电荷的离子, 在电场中会向一方迁移, 从而把蛋白质 分开, 这就是电解法制备几丁质的原理。实验中发 现
13、猴头菇用方法 2制备几丁质的质量更好些。用浓 碱在高温下直接使真菌菌丝体中的几丁质脱乙酰 基, 可以获得高脱乙酰基的壳聚糖产品。壳聚糖产 品中胺基含量与粘度、 离子交换能力、 絮凝能力和 N 选择性酰化能力有关, 是鉴定壳聚糖产品的主 要指标。由实验结果可见黑曲霉提取的壳聚糖产品 质量最好, 猴头菇和平菇的还需进一步提高。 对残糖残蛋白的测量发现过滤液中还剩留的糖 类蛋白类物质其数量级可达动物饲料营养标准。为 了综合利用, 可将菌种过滤液浓缩、 烘干, 混入饲料 中, 可降低生产饲料的成本并使真菌生产有了新用 途。 实验表明, 微生物提取法制备几丁质壳聚糖, 选 择菌种时应要求易培养、 细胞壁
14、含几丁质的量要高, 这样才有工业生产价值。根据这一原则, 米根霉、 灵 芝等真菌亦值得研究。 ? ? 参 考 文 献 1? 曹健、 殷蔚申, 黑曲霉几丁质和壳聚糖的研究, 微生物学报, 1995, 22( 4) :200 203 2? 刘佳铭, 草菇菌丝体中氨基酸和甲壳素的提取及鉴定, 化学通 报,1997, 3: 33 34 3? 汪志君, 碱量法测定壳聚糖中的胺量, 化学世界, 1986, 27( 1) : 22 23 4? 郑连英等, 壳聚糖质量分析和标准, 精细化工, 1993, 10: 16 18? 5? 奇云、 杜润才, 甲壳素及其衍生物的制备与应用, 现代化工, 1995, 1:
15、 15 20 6? Tsukamoto T, Kogad, Ide A,et al. Agric Biol chem. 1984, 48: 931 939 7? 陈盛等, 甲壳素脱乙酰度方法及测量比较, 化学世界, 1993, 8: 419 422 8? Muzzarelli R. A A. et al. Journalof Applied Biochemisitry. 1981, 3: 316 321 9? Zakaria Z, Hall GM, Shama G. Lactic acid fermentation of scampi waste in aprotating horizontal bioreacter for chitinrecovery - waste - disposal by Lactobacillus paracasei in fementor. Process Biochem. 1998. 33( 1) : 1 6 ?14?福建化工 ? ? 2000 年 ? ? 第 4 期
