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1、第二章 培养基及其配制,目的要求： 1、了解几种常用培养基的特点； 2、掌握培养基的主要成分及其作用； 3、掌握培养基的配制方法。,培养基(culture medium) ：,-是植物组织培养的重要基质。(土壤+自养条件） -不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。 因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。,一、培养基的种类,最早的培养基: 是Sacks(1680)和Knop(1681)，根据植物从土中主要是吸收无
2、机盐营养，设计出了由无机盐组成的Sacks和Knop溶液.,常用的培养基及特点如下： (1) MS培养基 1962年，Murashige和Skoog，培养烟草细胞。 特点：无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液；硝酸盐含量较其他培养基为高；应用广泛基本培养基 。 (2) B5培养基 1968年，Gamborg等，培养大豆根细胞。 特点：含有较低的铵，对有些植物的生长有抑制作用；适宜于双子叶植物特别是木本植物。 (3) White培养基 1943年，White，培养番茄根尖。 特点：无机盐数量较低，适于生根培养。 （4）N6培养基 1974年，朱至清等，水稻等禾谷类作物花药培养。 特点：成分较
3、简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。 (5) KM8P培养基 1974年，原生质体培养。 特点：有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。,二、培养基的成分,水、无机盐、有机物、天然复合物、 植物激素、培养体的支持材料、抗生素、 活性炭等。,（一）水 是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。 配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效
4、果。,（二）无机元素(inorganic element),大量元素： 指浓度大于0.5mmolL的元素等。其作用是： (1)N 是细胞质、细胞核、生物膜等的组成成分，是生命不可缺少的物质。 供应形式：NO3N、NH4N。NH4N对植物生长较为有利。 供应物质：KNO3、NH4NO3、 K2SO4、氨基酸等。 (2)P 是磷脂的主要成分。参与生物膜、核酸、ATP、ADP等的组成。 供应形式：磷酸二氢根、磷酸氢根 供应物质：KH2P04或NaH2P04等。 在植物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而且也促进对N的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。,(3)K 作用：对碳水化
5、合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。一般为13mgL为好。 供应物质：KCI、KN03等盐类提供。 (4)Mg、S和Ca Mg-是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S-是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。 Ca-是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用。,微量元素 指小于0.5mmolL的元素，Fe，B，Mn，Zn、Cu，Mo，Co等。 铁-是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分；是叶绿素形成的必要条件。对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。 供应物：鳌合铁（ FeSO47H20+Na2EDTA）在制做培养基时不用Fe2（SO4）3，和FeCl3
6、(因其在pH值52以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀)。 B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等：也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。,（三）有机化合物(organic compound),培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基（basic medium)。为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以下几类：,碳水化合物 最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。 蔗糖使用浓度在2%5%，常用3%，即配制一升培养基称取30g蔗糖。 高压灭菌时，一部分糖会发生
7、分解，制定配方时要给予考虑。在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。,维生素(vitamin) 以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。 VBl(盐酸硫胺素)：对愈伤组织的产生和生活力有重要作用。 VB6(盐酸吡哆醇)：能促进根的生长。 Vpp(烟酸)：与植物代谢和胚的发育有一定关系。 Vc（抗坏血酸）：有防止组织变褐的作用。 (酚类物质-醌) 一般用量：0110mgL。有时用量较高。有时还使用生物素、叶酸、VB12等。,肌醇 (myoinosltol)又叫环己六醇 作用： 能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。 对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用。 对细胞壁的形成
8、也有作用。 使用浓度：一般为lOOmgL，,氨基酸(almino acide) 是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。 常用的氨基酸：甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。 水解乳蛋白或水解酪蛋白：它们是牛乳用酶法等加工的水解产物，是含有约20种氨基酸的混合物，用量在10-1000mgL之间。由于它们营养丰富，极易引起污染。如在培养中无特别需要，以不用为宜。,（四）天然复合物,其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。它的成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用。,1)椰乳
9、 是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在10%20%，与其果实成熟度及产地关系也很大。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用，但茎尖组织的大小若超过1nun时，椰乳就不发生作用。 2)香蕉 用量为150-200mlL。用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色。对pH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。 3)马铃薯(potato) 去掉皮和芽后，加水煮30min，再经过过滤，取其滤液使用。用量为150200gL。对pH值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。 4)水解酪蛋白 为蛋白质的水解
10、物，主要成分为氨基酸，使用浓度为100200mgL。受酸和酶的作用易分解，使用时要注意。 5)其他 酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)，主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液(0.01%0.5%)、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。,（五）植物生长调节物(hormone), 植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动。 植物激素的种类： 促进生长：生长素、细胞分裂素、赤霉素 抑制生长：脱落酸
11、、乙烯 在培养基的各成分中，植物生长调节物是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。,1. 生长素类(auxin) 主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。 IAA(indo acetic acid吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小、，高温高压易被破坏，也易被细胞中的1AA分解酶降解，受光也易分解。 NAA(naphthalene acetic acid萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用
12、于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。 IBA(indolebutyri acid吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。 2，4D(2，4二氯苯氧乙酸)起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。,2. 细胞分裂素类 ( cytokinin ) 这类激素是腺嘌吟的衍生物，包括6BA(6苄基腺嘌呤)、Kt (kinetin 激动素)、Zt (zeatin 玉米素)等。其中Zt活性最强，但非常昂贵，常用的是6BA。 作用： 诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。 促进细胞分裂与扩大。 抑制根的分化。
13、 因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养时使用较少或用量较低。,3. GA ( gibberellic acid赤霉素) 作用： 促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株； 赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响。（当生长素赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化） 赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。,激素配比模式,生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向: 高 有利于根的形成和愈伤组织 的形成 生长素/细胞分裂素 适中 有利于根芽的分化、愈伤组织 低 有利于芽的形成 生长调节物质的使用甚微，一般用mgL表示浓度。在组织
14、培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异。 一般生长素浓度的使用为0.05-5mgL，细胞分裂素0.0510mgL。,Growth medium is optimised for regeneration of plantlets,No sucrose (0%),Sucrose reduced to 1%,Sucrose increased to 5%,The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface,Very
15、few shoots have developed on the explant. No roots and no callus.,Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occured,Shoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control medium,tissue
16、culture in the African Violet,No BA,BA reduced to 0.1 mg. l-1,No NAA,Poor shoot development and no roots. Extensive callus generation,Poor shoot development and no roots,NAA reduced to 0.1 mg. l-1,More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,Profuse development of roots and a reduced number of sho
