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1、第四章 体内药物分析方法 的建立与验证,2012-4,本章内容提要,分析方法的设计依据 分析方法建立的一般步骤 分析方法验证的内容与要求 分析方法验证的相关国际规范 体内药物分析应用示例,待测药物与生物介质 体内分析的目的 实验室的设备条件,第一节 分析方法的设计依据,待测药物与生物介质,（一）待测药物的结构与理化性质 (二)生物介质的种类与待测药物的形式 （三）待测药物的预期浓度范围,一、待测药物的理化性质及体内存在状况,1. 待测药物的理化性质 药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等决定预处理及检测方法 具有亲脂性：在适当的pH值下用溶剂萃取 具有强极性或亲水性：沉淀蛋白、固相萃取、离
2、子对萃 取或衍生化后萃取等 具有挥发性：GC测定法 具有光谱或电化学特性决定分析检测方法 药物的稳定性决定萃取浓缩技术 对酸碱不稳定，避免使用强酸或强碱性溶剂 对热不稳定，避免高温蒸发溶剂,2.待测药物的体内存在状态 与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低决定分离萃取方法 蛋白结合较强：不宜直接采用溶剂萃取，因萃取率低。 体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物与否决定分析检测技术 浓度较低（尤其有代谢产物共存） ： 代谢产物的干扰或原型药物与特定代谢产物的同时测定,可采用LC-MS、EIA等分析检测技术,二、分析测定的目的与要求,体内药物分析的目的影响分析方法的应用 药代动力学：研究药物在体内吸收、分
3、布、代谢和排泄过程 不必强调方法的简便、快速； 大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC、LC-MS 临床治疗药物监测： 测定有效治疗浓度范围内药物浓度 方法尽量简便、易行；适用于长期、批量样品的测定 大多采用UV、RIA或EIA等,三、生物样品的类型与样品制备方法,生物样品的类型、样品制备方法与分析方法密切相关 以血浆或血清为分析样品 采用蛋白沉淀-溶剂萃取预处理技术 分析样品较为“干净”，可用HPLC检测 用RIA分析 样品的预处理方法可较为粗放 经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定,四、实验室条件,在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的
4、仪器装备，合理选择可行的分析方法。,第二节 分析方法建立的一般步骤,分析方法的选择 分析方法的建立 1 检测条件的筛选 2 分离条件或预处理条件的筛选,一、分析方法的选择,生物样品中的药物浓度是决定分析方法的首要因素。 生物样品中药物或其特定代谢产物的浓度低、样品量少，难以通过增加取样量提高方法灵敏度，需通过选择适当的分析方法适应样品分析需求,生物样品分析方法的基本要求 ChP （2005） 首选色谱法，如HPLC、GC以及GC-MS、LC-MS联用技术，一般采用内标法定量。必要时也可采用生物学方法或生物化学方法。,二、分析方法的建立,分析方法建立之前 需查阅文献资料充分了解药物在体内的动力学
5、过程，使所拟定的分析方法避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定 文献查阅：摘要medline,CA；药学文摘，分析文摘。 全文各种杂志 移植或改进文献方法 建立新方法。,二、分析方法的建立,初步拟定分析方法后 进行一系列试验工作选择最佳分析条件 同时验证分析方法的可行性确认是否适用于实际生物样品 分析方法的建立和验证过程是不可截然划分的 为便于讨论而分别叙述 分析方法的建立步骤 第一步：检测条件的筛选 第二步：分离条件的筛选,取被测组分（药物或代谢产物）、内标物质的标准物质（对照品、标准品或符合标准的原料药）进行试验。 确定最佳检测条件和检测灵敏度（响应值） 色谱条件的确定,1 检测条件
6、的筛选,空白溶剂试验 以水代替生物基质，预处理样品 初步确定合适的预处理条件、考察溶剂的干扰情况、初步了解萃取回收率 空白生物基质试验 采用空白生物基质试验 考察生物基质对测定的干扰（方法专属性） 模拟生物样品试验 待测物加入到空白生物基质中试验 进一步考察生物基质对测定的干扰（方法专属性），确定最佳预处理条件，初步了解生物样品中可测定的最低浓度、方法的准确度、精密度、准确度，药物萃取回收率等。 实际生物样品的测试 预处理方法的最终建立。,2 分离条件（预处理条件）的筛选,第三节 分析方法验证的内容与要求,验证内容 1特异性避免干扰 2标准曲线与线性范围覆盖所有浓度范围 3精密度与准确度与实际
7、状况相符，结果可重现 4定量下限达到峰浓度的1/101/20 5稳定性确保所有样品在稳定状态下准确测定 6提取回收率确保准确度 方法质量控制：质控样品及其应用,一、方法特异性(专属性或选择性),系指当有内源性物质（其他组分）存在时，方法准确测定待测物质的能力。 专属性表示所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有的 选择性系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区分(分离)的能力 特异性函盖二者，以验证所测定的物质与待测药物的同一性。,考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点： 1内源性物质的干扰 2代谢产物的干扰 3伍用药物的干扰 4与参比方法的相关性,1 内源性物质的干扰,比较
8、待测组分在不同情况下的检测信号 对照品（或标准品） 空白生物基质 模拟生物样品（空白生物基质中添加对照品） 如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 是否一致 及与内源性物质色谱峰的 R 确证内源性物质对分析方法有无干扰,2 代谢产物的干扰,比较模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号 确证其它代谢产物对分析方法有无干扰 代谢产物峰的确定： 1 比较实际生物样品、模拟生物样品（或空白样品和对照） 2 由代谢产物的极性，初步判断其出峰位置； 3 在实际样品中峰面积随给药后时间延长而增加； 4 结构已知的特定活性代谢物的测定，通过HPLC-DAD和LC-MS确证色谱峰的单纯性和同一性，与对照物质比
9、较。 5 对于结构未知的代谢产物的测定，可采用LC-MS或LC-NMR进行结构的初步推测,3 伍用药物的干扰,TDM 时，还要考虑患者可能同时服用药物(通常为数有限)的干扰 比较待测药物、同时服用药物及二者模拟生物样品的检测信号（如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T ） 确证同时服用药物对分析方法的干扰情况,4 与参比方法的相关性,参比方法要求：一般选用特异性强、准确度高、线性关系良好的色谱法。 方法：同时用两种方法测定不同浓度的系列含药生物样品，以参比方法测定结果为横坐标(X)；拟定方法结果为纵坐标(Y)，用最小二乘法计算回归方程 YabX (坐标标度相等)。,结果比较：YabX 相关系数(
10、r) 表示两种方法测得结果的相关性，即呈比例变化的程度，而比例值即为回归方程的斜率b。 在截距a很小的前提下，若斜率b越趋近于1，则待考察方法越等同于参比方法。,二、标准曲线与线性范围,标准曲线（standard curve） 校正曲线（calibration curve） 工作曲线（working curve） 生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性。 线性范围（linear rang） 标准曲线的最高与最低浓度的区间。,采用回归方程来评价。 自变量x 为生物样品中待测药物的浓度，因变量y为响应信号的强度。 通常为线性模式，少数为非线性模式（IA方法）。 常用回归分析法：最小二乘法或加权最小
11、二乘法。 采用模拟生物样品建立（生物基质相同与真实样品相同）。 线性范围应能覆盖全部待测生物样品中的药物浓度，不能外推。,标准曲线的制备 将药物对照品（溶液）加入与待测样品相同的空白生物基质中混匀，配成已知药浓的标准样品，然后同待测样品一同按相同方法预处理后测定，将分析得到的响应值，对药浓建立标准曲线。 1 加入空白基质的原因： 使标准样品与待测样品均处于相同的生物基质环境中。 2 按相同方法预处理的原因 待测样品中的组分与标准样品中的组分以相同比例表现为响应值 3 标准样品中的浓度以单位生物基质中加入对照品量计算，因此药浓为总浓度。,标准系列溶液(非生物基质溶液)的制备 内标溶液的制备 标准
12、系列模拟生物样品（标准样品）的制备 标准曲线的绘制 回归方法：加权最小二乘法,1.标准曲线的一般建立方法,（1）标准系列溶液(非生物基质溶液)的制备,方法： 标准贮备液：精称待测物标准物质适量，用适宜溶剂溶解或定量稀释成较高浓度的溶液。 标准溶液：稀释标准贮备液 注意： 溶剂：水或甲醇（或其他适当溶剂） 浓度：标准模拟生物样品中药物浓度的 50倍以上，加入体积为生物样品总体积的 2%以下，避免标准模拟生物样品与实际样品存在较大差异。难溶，浓度较低：应除去溶剂后再加入生物基质。 浓度点：68个，覆盖全部待测生物样品中的药物浓度 梯度模式：不固定。通常为等比，常数约为2 。,例如： 1、2、5、1
13、0、20、50、100ug/ml 设定最高浓度为100，最低浓度为1 (个体差异) 实际配制时首先配制高浓度，再稀释配制低浓度。,（2）内标溶液的制备,方法：先配制内标贮备液，再配制内标液 浓度要求： 内标溶液的响应值一般与“标准系列溶液”的中间浓度溶液的响应值相当。 加入内标的原因： 避免样品预处理过程中的损失对结果的影响。,（3） 标准样品的制备,方法：空白生物基质(如血浆) 数份，分别加入标准系列溶液适量（相同体积），涡旋混匀。 或者：先加标准溶液，再加基质 或蒸干后加基质。,（4）标准曲线的绘制,方法：取标准样品预处理后，以待测药物的检测响应(如色谱峰面积或峰高) 或与内标物质的检测响
14、应的比值(内标法)(因变量, y )对模拟血药浓度 (自变量,x)，求得回归方程( yabx )及其相关系数( )，并绘制标准曲线。 至少6-8个浓度点(不包括零点)构成 数据剔除应有确切原因，如： 样品处理有损失、色谱图有问题， 显著偏离标准曲线该数据参与标准曲线回归后，计算QC样品或返算该点浓度时显著偏离其标准浓度(配制浓度),标准曲线药物浓度表示 以单位体积（质量）生物基质中加入标准物质的量表示。 如：空白血浆0.5ml，加入标准溶液（100ug/ml）10ul（或还有其他溶液） ， 浓度为：2ug/ml。 组织可用ug/g，根据所取匀浆体积所相当的组织重量中加入标准物质的量计算。,（4
15、） 标准曲线的绘制,（5）加权最小二乘法,普通最小二乘法：每个浓度点绝对误差(yiyi)赋予同等的重要性 特点：标准曲线上的高低浓度相差悬殊(范围达102) 低浓度区的计算值相对误差过大，难以满足规定要求 加权最小二乘法：回归计算时增加一个权重因子(w) 各浓度的响应值与回归值的相对离差平方和达到最小 式中，wi为标准曲线上第i个浓度点的权重因子,（5）加权最小二乘法,回归方程(y = a + b x)参数的计算,（5）加权最小二乘法,权重因子的选择 加权：赋予低浓度点以更大的权重 在实际工作中的一般方法 通常取wi=1/C2 当高浓度点测量值的准确度下降过大，低浓度点权重过大，降低低浓度点的
16、权重，wi=1/C,2. 标准曲线的限度要求,药代动力学或生物利用度研究 1 标准曲线至少包括6个浓度(通常为68个浓度,不包括零点) 2 线性范围应能覆盖全部待测生物样品中的药物浓度，最高浓度应高于达峰浓度(Cmax)；最低浓度应低于Cmax的1/101/20，常为方法的LLOQ(非LOD) 3 标准曲线各浓度点的计算值（依据回归方程推算的浓度）与标示值之间的偏差在可接受的范围之内时，标准曲线合格。 4 回归方程的截距应接近于零,5 斜率应接近或大于1（与坐标的标度选择有关），使具有较高的灵敏度 6 相关系数要求 0.99(色谱法)或0.98(生物学方法) 7 若非线性，可分为高低两个浓度区间(每个区间不少于5个浓度)，分别加权回归如1、2、5、10、20和10、20、50、100、200,标准曲线 样品测定 空白生物基质
