【最新word论文】Stat3信号转导通路调控bcl2成员表达及抑制结肠癌细胞凋亡的机制【医学专业论文】

1Stat3 信号转导通路调控 bcl2 成员表达及抑制结肠癌细胞凋亡的机制作者：马向涛，余力伟，王杉，张在兴，杜如昱，崔志荣【摘要】目的转录信号转导子与激活子3（Signaltransducersandactivatorsoftranscription3,Stat3）通路受细胞因子与生长因子的刺激而活化，参与调节细胞的增殖、分化与凋亡，探讨 Stat3 反义寡核苷酸诱导结肠癌细胞凋亡的作用机制方法用阳离子脂质体介导 Stat3 反义寡核苷酸转染人结肠癌 HCT116 细胞，MTT 法检测细胞增殖状态；流式细胞术检测细胞周期与凋亡；Westernblot 检测 Stat3、磷酸化 Stat3 及凋亡家族成员bcl2 、bclxL 、Mcl1 、Caspase3 的表达结果转染 Stat3 反义寡核苷酸后 HCT116 细胞增殖受抑制，凋亡细胞增多，Stat3、pStat3 与 bcl2 家族成员表达水平下降结论 Stat3 信号转导通路活性增高可能与结肠癌发生发展有关，阻断 Stat3 通路可以诱导结肠癌细胞凋亡关键词】结肠癌；信号转导通路；增殖；凋亡Stat3SignalingPathwayRegulatestheExpressionofbcl2FamilyMembersandPromotesSurvivalofHumanColonCancerCellsAbstract：ObjectiveSignaltransducerandactivatoroftranscription3(Stat3)isactivatedinresponsetocytokinesandgrowthfactorsstimulation,andactivationofStat3isinvolvedinmodulatingcellproliferation,differentiationandapoptosis.ThepurposeofthestudywastoexaminecoloncancercelllinestodeterminewhetherStat3playsanimportantroleintheprocessofapoptosisincoloncancercells.MethodsProteinlysateswereextractedfromcoloncancercells.HumancoloncancercelllineHCT116wastransfectedwithStat3antisenseoligonucleotidemediatedbyliposome,MTTassaywasusedtomeasuretheproliferation,flowcytometrywasappliedtoanalyzethecellcycleandapoptosis,theexpressionofStat3,pStat3,bcl2,bclxL,Mcl1andCaspase3weremeasuredbywesternblot.ResultsTargetingofStat3usingantisenseoligonucleotidedirectedagainstthetranslationsite,resultedinapoptosisanddownregulationofStat3,pStat3andbcl2familymembers.ConclusionConstitutiveactivationofStat3isassociatedwiththecarcinogenesisofcoloncancercells.BlockingofStat3signalingcouldinduceapoptosisofcoloncancercells.Keywords：Colonneoplasm；Signaltransductionpathway；Proliferation；Apoptosis0 引言2Stat3 是转录信号传导子与激活子通路（SignalTransducersandActivatorsofTranscription，STATs）的重要成员，该通路接受生长因子与细胞因子等细胞外信号刺激，调节细胞增殖、分化及凋亡[1]。

目前已发现 Stat3 在白血病、胃癌、头颈部鳞癌及乳腺癌等多种肿瘤组织及细胞系中呈持续活化[25] ，但是关于 Stat3 在调控结肠癌细胞凋亡过程中的作用还有待进一步研究本研究应用 Stat3 反义寡核苷酸转染人结肠癌细胞，探讨Stat3 信号转导通路调控结肠癌细胞凋亡的机制1 材料和方法1.1 细胞培养结肠癌细胞 HCT116 由北京大学人民医院外科肿瘤研究室保存，培养于含有10%胎牛血清（美国 HyClone 公司）的 RPMI1640 培养基（美国 GIBCOL/BRL 公司） 1.2Stat3 寡核苷酸的合成与纯化Stat3 反义寡核苷酸根据 Stat3 翻译起始点合成，同时本研究还设立了正义寡核苷酸链和错配寡核苷酸链作为对照组，错配链的序列在 GenBank 数据库进行同源性检索，未发现同源序列Stat3 反义寡核苷酸序列：5′CCATTGGGCCATCCTGTTTCT3′；Stat3 正义寡核苷酸序列：5′AGAAACAGGATGGCCCAATGG3′；Stat3 错配寡核苷酸序列：5′CCATTGCGCCATCGTGTTACT3′以上寡核苷酸由美国 SantaCruz 公司合成及纯化。

1.3 阳离子脂质体转染阳离子脂质体 LipofectAmine2000（美国 GIBCOL/BRL 公司） ，转染过程参照GIBCOL/BRL 公司手册1.4 细胞增殖状态检测（MTT 法）取第 3～6 代生长状态良好的对数生长期细胞，常规消化、分离、收集细胞、细胞计数及测定细胞活力，活细胞率达 95%，按每孔 4.0×105 个细胞接种于 96孔板中，贴壁后，无血清培养细胞 16～24h，使细胞同步化实验分为以下 4 组：（1）空白对照加无血清培养组；（2）正义寡核苷酸组；（3）错配寡核苷酸组；（4）反义寡核苷酸组，每个研究点设置 3 组平行对照，重复 3 次实验取平均值分别加入脂质体及 Stat3 正义寡核苷酸、错配寡核苷酸与反义寡核苷酸继续培养，浓度分别为 0、5、10、20μM，第 0、24、48、72h 分别加入 MTT5mg/ml（美国Sigma 公司） ，继续培养 4h，每孔加入 DMSO200ml，酶标仪测定 540nm 吸收值，绘制生长曲线，见图 131.5 细胞周期检测细胞同步化后分别加入脂质体及 Stat3 正义寡核苷酸、错配寡核苷酸与反义寡核苷酸继续培养，第 0、24、48、72h 分别消化细胞，0.5mlPBS 重悬细胞，70%冰乙醇固定细胞过夜，加入 RNAaseA 至终浓度 50mg/ml，37℃恒温水浴 1h，加入PI（美国 Sigma 公司）至终浓度 50mg/ml，4℃避光染色 1h，上流式细胞仪FACScan（美国 BectonDickinson 公司）检测，资料用 CellQuest 细胞周期分析软件处理。

1.6 细胞凋亡检测同步化处理及单细胞悬液制备同前，应用凋亡检测试剂盒，PBS 离心洗涤 2次，200ml 结合缓冲液重悬，加入 ANNEXTINVFITC 至终浓度 1mg/ml，加入 PI至终浓度 2.5mg/ml，室温避光染色 15min，上流式细胞仪检测1.7Westernblot参照 SantaCruz 公司提供的蛋白提取方法，分别裂解结肠癌细胞与组织得到总蛋白以牛血清蛋白（BSA）作为标准品，根据蛋白定量试剂盒（美国BioRad 公司）手册绘制蛋白定量标准曲线，于分光光度计 595nm 下测吸光值，计算出提取液的蛋白浓度取总蛋白 50μg，7.5%～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电转移到 PVDF 膜上，封闭后，加入一抗Stat3、pStat3 、bcl2 、bclxL 、Mcl1 、Caspase3 抗体（美国SantaCruz 公司） ，工作浓度 1∶1000，GAPDH 作为内参照，辣根过氧化物酶结合的二抗，工作浓度 1∶1000用 ECL 化学发光试剂盒检测杂交信号1.8 吸光度测定用 PhosphoImager 图像分析仪（美国 MolecularDynamics 公司）测定条带的吸光度（A 值） ，以 A 值代表蛋白的相对表达量。

1.9 统计学方法应用 SPSS12.0 统计学软件，采用 t 检验，P<0.05 差异有统计学意义2 结果2.1Stat3 反义寡核苷酸可以抑制结肠癌细胞增殖Stat3 反义寡核苷酸作用 HCT116 细胞 72h 后，G1 期细胞比率由 68.9%上升至 85.6%，S 期细胞比率由 15.4%下降至 7.6%，细胞增殖受抑制，见图 22.2Stat3 反义寡核苷酸可以促进结肠癌细胞凋亡4HCT116 细胞在转染 Stat3 反义寡核苷酸 72h 后，凋亡细胞百分比由 5.6%增加至 27.5%，见图 32.3Stat3 反义寡核苷酸可以使 Stat3 信号传导通路成员活性与表达下降HCT116 细胞转染 Stat3 反义寡核苷酸 72h 后，Stat3 蛋白表达与活性下调，其靶基因产物 bcl2 成员表达下降，见图 43 讨论Stat3 在人类白血病、多发性骨髓瘤、头颈部鳞状细胞癌、乳腺癌、前列腺癌以及肺癌等多种肿瘤组织与细胞系中异常表达或活性增强[26]Ma 等[7]发现 Stat3 在结肠癌细胞中持续活化，但是关于 Stat3 调控结肠癌细胞凋亡的机制还有待研究Stat3 靶基因产物包括影响细胞凋亡的 bcl2 家族成员。

bcl2 与bclxL 是 bcl2 家族蛋白成员中主要的抑凋亡分子[8]，在白血病、神经母细胞瘤、骨髓瘤、结直肠癌等多种肿瘤中呈异常表达[911]bclx 基因启动子上存在多个 Stat3 结合位点，Stat3 可直接与 bclx 启动子结合而启动转录Burke 等[12]应用酪氨酸激酶抑制剂 AG490 阻断卵巢癌细胞 Stat3 通路后，bclxL 蛋白表达下调，卵巢癌细胞出现凋亡Lai 等[13]在头颈部鳞状细胞癌细胞中也得到相似结果然而 bcl2 家族成员表达并非是决定细胞凋亡与否的唯一因素，其翻译后修饰也是调节细胞凋亡的关键因素之一胱冬肽酶（Caspase）是一类天冬氨酸残基特异性的半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡过程中起关键作用，它们对 bcl2 家族成员具有重要的酶解修饰作用，目前已发现十余种成员，包括 Caspase110 等[14]本研究应用Stat3 反义寡核苷酸转染结肠癌细胞系 HCT116，可以阻断其内源性 Stat3 信号转导通路，Stat3 及磷酸化 Stat3 表达下调，bcl2 成员表达下降，Caspase3变化不明显，凋亡细胞增加，Stat3 可能通过影响 Bcl2 家族成员调控结肠癌细胞凋亡，但是其详细机制有待进一步研究。

总之，Stat3 信号转导通路在结肠癌细胞中的转录调控机制尚不清楚，Stat3 的异常激活与结肠癌细胞凋亡关系还有待于进一步明确实验动物模型及临床观察中发现，肿瘤细胞耐受化疗与 Stat3 与 bcl2 成员异常增高有关[15]，5阻断 Stat3 通路可诱导耐药肿瘤细胞凋亡已有一些学者在研究将 Stat3 作为基因治疗靶基因的可能性，并取得了初步结果，深入研究 Stat3 信号转导通路作用机制有可能为治疗结肠癌提供新的理论和实验基础致谢：感谢 Dr.LimeiMa 与 Dr.CongrongYu（美国StowersInstituteforMedicalResearch）对本研究提供的技术支持参考文献】［1］LevyDE,DarnellJEJr.Stats:transc。