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1、将外源（某载体上的水稻）DNA片段亚克隆到另一载体上。,第一部分：分子克隆技术,pU1301,pU1301+1.5KB外源,双酶切： BamHI+KpnI,pUC19,两种载体的抽提 琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量 两种载体的限制性内切酶消化 目的片段的回收及亚克隆载体的去磷酸化 载体与外源DNA的连接 感受态细胞的制备 连接子转化感受态细胞 重组子筛选及鉴定,分子克隆的主要步骤,质粒载体的提取,是一个复制子，载体在受体细胞中能大量繁殖，其携带的外源基因才能在受体细胞中得到大量扩增； 有1到多个限制内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入； 具有选择性的遗传标记(如抗生素抗性标记等)，以
2、此知道它是否已进入受体细胞，并据此标记将携带载体的细胞从其他细胞中分离出来。,载体必备条件,质粒是携带外源基因进入宿主细胞、扩增或表达外源基因的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。 质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。,双链闭合环状DNA分子，具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它所携带的遗传信息。它可独立游离于细胞质中，也可整合到细菌染色体上。 质粒在细胞内的复制可分为严谨型（只在细胞周期的一定阶段进行复制，一个细胞内只有1至几个拷贝）和松弛型（细胞周期中随时可以复制，拷贝数较多，一般在细胞内有20个以上）。,质粒的基本特点,碱裂解法，主要包括4个步骤：
3、 细菌的培养：从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素的培养基中，培养至对数生长后期； 菌体的收集和裂解：通过离心收集菌体，NaOH/SDS处理裂解细胞； 染色体DNA 、RNA 及其它杂质的去除：碱处理后用冰冷的KAC 缓冲液处理后离心； 质粒的纯化及沉淀：苯酚氯仿抽提，乙醇或异丙醇沉淀。,质粒的提取,Solution I: Tris.HCl （pH 7.5） 50 mM EDTA 10 mM RNase A 100 g/ml Solution II: NaOH 0.2 M SDS 1 % Solution III: Final concentration KAC 1.32 M Using HA
4、C to adjust pH to 4.8 TE (pH 8.0)： Tris.HCl （pH 8.0） 10 mM EDTA （pH 8.0） 1 mM 苯酚/氯仿 无水乙醇或异丙醇,碱裂解法用到的试剂,Solution I: 重悬细菌; Solution II: 其中的SDS破坏细胞壁、膜，使细胞内容物释放出来，NaOH 使DNA变性、碱基对打开，使宿主染色体DNA双链分开，而闭合环状的质粒DNA处于拓扑缠绕状态，两个环并不分开;,试剂的作用（一）,Solution III中和后，宿主DNA由于很大，碱基还未来得及配对就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起沉淀下来，
5、而质粒DNA由于很小且双链未分开，能够迅速配对重新形成超螺旋，处于溶解状态。,试剂的作用（二）,试剂的作用（三）,苯酚/氯仿： 纯化质粒，去除质粒溶液中残留的蛋白质等杂质； 无水乙醇或95%乙醇或异丙醇：沉淀质粒DNA TE 或H2O：溶解质粒DNA,实验材料,携带pUC19质粒载体的大肠杆菌菌液； 携带含有水稻DNA片段的pU1301载体的大肠杆菌菌液。,操作步骤,取含有相应载体的大肠杆菌菌液于含有相应抗生素的LA培养基上涂布或划线分离单菌落，37过夜培养）； 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的LB培养基中，37摇床250 r/min过夜培养；,吸取1.5 ml菌液，12000 g
6、离心1分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净； 加入300l Solution I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）； 加入300l Solution II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟（最好不超过2分钟）； 加入300l Solution III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；,12000 g离心10分钟； 吸取800l 上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一个1.5ml 离心管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟； 12000 g 常温离心15分钟； 倒尽上清，加500 l 75乙醇
7、浸洗除盐，（放置片刻后离心5分钟，弃上清） 彻底干燥后加40l 灭菌超纯水溶解； 质粒的质量检测，-20保存。,氨苄青霉素（Ampicillin）：其主要是通过抑制细胞壁的合成杀死正在生长的大肠杆菌。 氨苄青霉素抗性基因（ampr）：合成-内酰胺酶，在氨苄青霉素进入细胞之前将其水解(使用浓度100g/ml) 卡那霉素（Kanamycin sulfate）：核糖体结合，抑制蛋白质的合成（使用浓度：50g/ml) RNaseA: C或U的3P与相邻的5OH处切开RNA。 配制：一般以10mg/ml溶于TE中，然后在沸水中煮15分钟，分装成小份储存于20。,试验中用到的抗生素和酶,DNA纯度：吸光值
8、检测：检测260nm、280nm吸光值，紫外分光光度计A260/A280=1.81.9； 1.8最佳，低于1.8说明有蛋白质，大于1.8说明有RNA。 质量检测：琼脂糖凝胶电泳：一般有三条带（超螺旋、开环、线型三种构型），点样孔附近无DNA带（无染色体DNA污染）。,质粒DNA质量检测,Hoechst33258:可与纳克级的DNA结合，而几乎没有RNA亲和性，激发波长365nm，发射波长460nm。0.1g/ml Hoechst33258适用于检测500ng/ml的DNA浓度，染料增加到1g/ml，分析范围可延至15g/ml，但会降低一定的灵敏度。 缺点：更易于结合AT丰富区，对DNA组成敏感
9、。 EB:与DNA组成无关，但不如Hoechst33258敏感，且能结合RNA，激发波长302nm，发射波长590nm。,3. DNA的定量,（1）荧光检测仪,1 OD50 g/ml DS-DNA 或 1 OD 40 g/ml RNA or SSDNA,（2.）分光光度计,琼脂糖凝胶电泳检测,将洗净、干燥的制胶板放入制胶槽中，水平放置在工作台上； 称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至温热时倒胶； 凝胶凝固后，小心拔去梳子；,将5l DNA样品与1l上样缓冲液和4l H2O混合后依次加入点样孔中； 将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪
10、，使核酸样品向正极泳动（注意点样孔在电泳槽的负极一端）； 电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 g/ml的溴化乙锭（EB）中浸泡1015 min，在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。,质粒电泳检测,一般有一至三条带（质粒DNA的三种构型）,开环 线型 超螺旋,不同末端克隆的要求及特点,限制性内切酶 碱性磷酸酶 连接酶,几种工具酶,限制酶的一个活性单位（1U）：原则上指在50l 反应体系中，37下，经过1小时的反应将1 g 的DNA完全分解所需要的酶量。 限制酶的Star活性：限制酶在极端非标准条件下使用时对底物DNA的特异性可能降低，即可将与原来识别的特定DNA序列不同的碱基序列切断，这
11、种现象叫限制酶的star活性。它的出现的频率与酶、底物及反应条件有关。,高浓度的甘油（5）； 酶过量（100U/ug）； 低离子强度（pH8.0)； 有机溶剂（DMSO，乙醇，乙二醇，二甲基乙酰胺； 用其他二价阳离子代替Mg2+(Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+) 不同的酶对上述因素的敏感程度不同,引起星星活性的主要因素,氯化镁、氯化钠/钾、Tris盐酸盐、 巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）、 牛血清白蛋白（BSA）,典型的限制性内切酶作用的缓冲体系成分包括：,注意,注意阅读商家提供的产品说明书，了解所使用工具酶的浓度和最适作用条件，不要用错了Buffer和作用的温度等； 涉及到酶的操作时
12、,一律在冰上操作； 使用移液器吸取酶时，tip头只能刚刚插入液面吸取； 如果有多个反应，酶、buffer、水等应配制成mixture再分装； 各种成分加完后应混匀，然后在离心机上短暂离心。,BamH I： GGATT C C CTAAG,Kpn I: G GTACC CCATG G,含外源DNA片段的载体(M812),（50 l反应体系，用1.5 ml tube，冰上操作）,质粒 DNA 30 l BamH I (10u/l) 1 l x 9 = 9ul Kpn I (10u/l) 1 l x 9 = 9ul 10buffer 5 l x 9 = 45ul ddH2O 13 l x 9 = 1
13、17ul,分别取5 l 酶切产物用0.81.2%凝胶检测酶切效果,50 l,Total,目的载体（pUC19),的限制性内切酶消化,电泳检测,Marker pUC19质粒对照 pUC19质粒酶切产物 M812 质粒对照 M812 质粒酶切产物,点样顺序：,2011本科生酶切图片,lane1-4, pUC19酶切产物 Lane5 , pUC19质粒 Lane6， M812质粒 Lane7-10, M812 酶切产物 Lane11, DL-2000 marker,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11,2010学生酶切图片,lane1-4, pUC19 酶切产物 lane5-8, M812
14、 酶切产物 无marker, 无质粒对照,1 2 3 4 5 6 7 8,造成DNA酶切不完全的主要原因,DNA问题：不干净，反应体系中存在酶的抑制剂；被甲基化；酶切后DNA粘末端退火；识别位点的两侧插入了影响酶切效率的序列； 操作不当：酶或DNA粘在管壁上，反应体系没完全混合；酶粘度大，取样不准或酶稀释不正确； 反应条件不合适，用错了缓冲液或温度不合适; 酶的问题：活力不够；强烈振荡使酶变性；过度稀释使酶活性降低等。,DNA样品中抑制酶活的污染物主要,DNA 样品中的蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高浓度的盐等均能抑制酶切活性。,解决办法：,增加酶作用的单位数（10-20U/g D
15、NA)； 增大反应体积以稀释可能的抑制剂； 延长反应时间； 消化基因组DNA时，加入终浓度1-2.5m mol/L多聚阳离子亚精胺可改善酶切效果，其作用是结合带负电荷的污染物； 纯化DNA。,酶切反应的终止,加入终农度为12.5m mol/L的EDTA以鳌合镁离子而终止酶的反应； 多数酶在65C 10分钟可被不可逆灭活，少数65C不失活的酶在75 C 15分钟也能失活； 若酶对热具完全抗性，可通过酚抽提乙醇沉淀来纯化。,酶切产物的纯化(pUC19),加入ddH2O 155 l （扩大体积），加入200l氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀后12000rpm离心10 min； 吸出上清，加1/10
16、体积3M NaAc和两倍体积乙醇，-20放置15分钟以上； 12000 rpm 4冷冻离心15分钟； 倒去上清，用500 l 75乙醇浸洗沉淀； 12000 rpm 4冷冻离心5分钟; 吹干后 DNA溶于10 l ddH2O。,氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏，操作时需戴手套、安全镜并在通风橱中进行。 苯酚是强腐蚀剂，能引起严重烧伤；操作时应戴手套、安全镜、穿防护服，并在通风橱中进行。,注意,当一个体系中有多种DNA分子，而我们只需要其中的某种DNA时或者反应体系中含有目的DNA以外的其它分子如各种工具酶、dNTPs、引物及矿物油等时，可以利用凝胶电泳分离各种DNA，然后挖胶回收目的DNA 带。 回收方法主要有： 1.低熔点琼脂糖 2.透析带电洗脱
