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1、将外源(某载体上的水稻)DNA片段亚克隆到另一载体上。,第一部分:分子克隆技术,pU1301,pU1301+1.5KB外源,双酶切: BamHI+KpnI,pUC19,两种载体的抽提 琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量 两种载体的限制性内切酶消化 目的片段的回收及亚克隆载体的去磷酸化 载体与外源DNA的连接 感受态细胞的制备 连接子转化感受态细胞 重组子筛选及鉴定,分子克隆的主要步骤,质粒载体的提取,是一个复制子,载体在受体细胞中能大量繁殖,其携带的外源基因才能在受体细胞中得到大量扩增; 有1到多个限制内切酶的单一识别与切割位点,便于外源基因的插入; 具有选择性的遗传标记(如抗生素抗性标记等),以
2、此知道它是否已进入受体细胞,并据此标记将携带载体的细胞从其他细胞中分离出来。,载体必备条件,质粒是携带外源基因进入宿主细胞、扩增或表达外源基因的主要载体,它在基因操作中具有重要作用。 质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。,双链闭合环状DNA分子,具有自主复制和转录能力,能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数,可表达它所携带的遗传信息。它可独立游离于细胞质中,也可整合到细菌染色体上。 质粒在细胞内的复制可分为严谨型(只在细胞周期的一定阶段进行复制,一个细胞内只有1至几个拷贝)和松弛型(细胞周期中随时可以复制,拷贝数较多,一般在细胞内有20个以上)。,质粒的基本特点,碱裂解法,主要包括4个步骤:
3、 细菌的培养:从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素的培养基中,培养至对数生长后期; 菌体的收集和裂解:通过离心收集菌体,NaOH/SDS处理裂解细胞; 染色体DNA 、RNA 及其它杂质的去除:碱处理后用冰冷的KAC 缓冲液处理后离心; 质粒的纯化及沉淀:苯酚氯仿抽提,乙醇或异丙醇沉淀。,质粒的提取,Solution I: Tris.HCl (pH 7.5) 50 mM EDTA 10 mM RNase A 100 g/ml Solution II: NaOH 0.2 M SDS 1 % Solution III: Final concentration KAC 1.32 M Using HA
4、C to adjust pH to 4.8 TE (pH 8.0): Tris.HCl (pH 8.0) 10 mM EDTA (pH 8.0) 1 mM 苯酚/氯仿 无水乙醇或异丙醇,碱裂解法用到的试剂,Solution I: 重悬细菌; Solution II: 其中的SDS破坏细胞壁、膜,使细胞内容物释放出来,NaOH 使DNA变性、碱基对打开,使宿主染色体DNA双链分开,而闭合环状的质粒DNA处于拓扑缠绕状态,两个环并不分开;,试剂的作用(一),Solution III中和后,宿主DNA由于很大,碱基还未来得及配对就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起沉淀下来,
5、而质粒DNA由于很小且双链未分开,能够迅速配对重新形成超螺旋,处于溶解状态。,试剂的作用(二),试剂的作用(三),苯酚/氯仿: 纯化质粒,去除质粒溶液中残留的蛋白质等杂质; 无水乙醇或95%乙醇或异丙醇:沉淀质粒DNA TE 或H2O:溶解质粒DNA,实验材料,携带pUC19质粒载体的大肠杆菌菌液; 携带含有水稻DNA片段的pU1301载体的大肠杆菌菌液。,操作步骤,取含有相应载体的大肠杆菌菌液于含有相应抗生素的LA培养基上涂布或划线分离单菌落,37过夜培养); 用无菌牙签挑取单菌落,接种于含有相应抗生素的LB培养基中,37摇床250 r/min过夜培养;,吸取1.5 ml菌液,12000 g
6、离心1分钟,收集菌体,倒掉菌液;吸取1.5 ml菌液,再次收集菌体,尽量将菌液倒干净; 加入300l Solution I振荡打匀,重新悬浮细胞,震荡混匀(注意:应彻底打匀沉淀或碎块); 加入300l Solution II,轻柔颠倒混匀,放置至清亮,一般不超过5分钟(最好不超过2分钟); 加入300l Solution III颠倒混匀,放置于冰上10分钟,使杂质充分沉淀;,12000 g离心10分钟; 吸取800l 上清液(注意:不要吸取到飘浮的杂质)至另一个1.5ml 离心管中,加入2/3体积的异丙醇,室温下放置5分钟; 12000 g 常温离心15分钟; 倒尽上清,加500 l 75乙醇
7、浸洗除盐,(放置片刻后离心5分钟,弃上清) 彻底干燥后加40l 灭菌超纯水溶解; 质粒的质量检测,-20保存。,氨苄青霉素(Ampicillin):其主要是通过抑制细胞壁的合成杀死正在生长的大肠杆菌。 氨苄青霉素抗性基因(ampr):合成-内酰胺酶,在氨苄青霉素进入细胞之前将其水解(使用浓度100g/ml) 卡那霉素(Kanamycin sulfate):核糖体结合,抑制蛋白质的合成(使用浓度:50g/ml) RNaseA: C或U的3P与相邻的5OH处切开RNA。 配制:一般以10mg/ml溶于TE中,然后在沸水中煮15分钟,分装成小份储存于20。,试验中用到的抗生素和酶,DNA纯度:吸光值
8、检测:检测260nm、280nm吸光值,紫外分光光度计A260/A280=1.81.9; 1.8最佳,低于1.8说明有蛋白质,大于1.8说明有RNA。 质量检测:琼脂糖凝胶电泳:一般有三条带(超螺旋、开环、线型三种构型),点样孔附近无DNA带(无染色体DNA污染)。,质粒DNA质量检测,Hoechst33258:可与纳克级的DNA结合,而几乎没有RNA亲和性,激发波长365nm,发射波长460nm。0.1g/ml Hoechst33258适用于检测500ng/ml的DNA浓度,染料增加到1g/ml,分析范围可延至15g/ml,但会降低一定的灵敏度。 缺点:更易于结合AT丰富区,对DNA组成敏感
9、。 EB:与DNA组成无关,但不如Hoechst33258敏感,且能结合RNA,激发波长302nm,发射波长590nm。,3. DNA的定量,(1)荧光检测仪,1 OD50 g/ml DS-DNA 或 1 OD 40 g/ml RNA or SSDNA,(2.)分光光度计,琼脂糖凝胶电泳检测,将洗净、干燥的制胶板放入制胶槽中,水平放置在工作台上; 称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5TBE中,在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解,冷却至温热时倒胶; 凝胶凝固后,小心拔去梳子;,将5l DNA样品与1l上样缓冲液和4l H2O混合后依次加入点样孔中; 将制胶板放入电泳槽中,加入电泳液,打开电泳仪
10、,使核酸样品向正极泳动(注意点样孔在电泳槽的负极一端); 电泳完成后切断电源,取出凝胶,放入0.5 g/ml的溴化乙锭(EB)中浸泡1015 min,在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。,质粒电泳检测,一般有一至三条带(质粒DNA的三种构型),开环 线型 超螺旋,不同末端克隆的要求及特点,限制性内切酶 碱性磷酸酶 连接酶,几种工具酶,限制酶的一个活性单位(1U):原则上指在50l 反应体系中,37下,经过1小时的反应将1 g 的DNA完全分解所需要的酶量。 限制酶的Star活性:限制酶在极端非标准条件下使用时对底物DNA的特异性可能降低,即可将与原来识别的特定DNA序列不同的碱基序列切断,这
11、种现象叫限制酶的star活性。它的出现的频率与酶、底物及反应条件有关。,高浓度的甘油(5); 酶过量(100U/ug); 低离子强度(pH8.0); 有机溶剂(DMSO,乙醇,乙二醇,二甲基乙酰胺; 用其他二价阳离子代替Mg2+(Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+) 不同的酶对上述因素的敏感程度不同,引起星星活性的主要因素,氯化镁、氯化钠/钾、Tris盐酸盐、 巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)、 牛血清白蛋白(BSA),典型的限制性内切酶作用的缓冲体系成分包括:,注意,注意阅读商家提供的产品说明书,了解所使用工具酶的浓度和最适作用条件,不要用错了Buffer和作用的温度等; 涉及到酶的操作时
12、,一律在冰上操作; 使用移液器吸取酶时,tip头只能刚刚插入液面吸取; 如果有多个反应,酶、buffer、水等应配制成mixture再分装; 各种成分加完后应混匀,然后在离心机上短暂离心。,BamH I: GGATT C C CTAAG,Kpn I: G GTACC CCATG G,含外源DNA片段的载体(M812),(50 l反应体系,用1.5 ml tube,冰上操作),质粒 DNA 30 l BamH I (10u/l) 1 l x 9 = 9ul Kpn I (10u/l) 1 l x 9 = 9ul 10buffer 5 l x 9 = 45ul ddH2O 13 l x 9 = 1
13、17ul,分别取5 l 酶切产物用0.81.2%凝胶检测酶切效果,50 l,Total,目的载体(pUC19),的限制性内切酶消化,电泳检测,Marker pUC19质粒对照 pUC19质粒酶切产物 M812 质粒对照 M812 质粒酶切产物,点样顺序:,2011本科生酶切图片,lane1-4, pUC19酶切产物 Lane5 , pUC19质粒 Lane6, M812质粒 Lane7-10, M812 酶切产物 Lane11, DL-2000 marker,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11,2010学生酶切图片,lane1-4, pUC19 酶切产物 lane5-8, M812
14、 酶切产物 无marker, 无质粒对照,1 2 3 4 5 6 7 8,造成DNA酶切不完全的主要原因,DNA问题:不干净,反应体系中存在酶的抑制剂;被甲基化;酶切后DNA粘末端退火;识别位点的两侧插入了影响酶切效率的序列; 操作不当:酶或DNA粘在管壁上,反应体系没完全混合;酶粘度大,取样不准或酶稀释不正确; 反应条件不合适,用错了缓冲液或温度不合适; 酶的问题:活力不够;强烈振荡使酶变性;过度稀释使酶活性降低等。,DNA样品中抑制酶活的污染物主要,DNA 样品中的蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高浓度的盐等均能抑制酶切活性。,解决办法:,增加酶作用的单位数(10-20U/g D
15、NA); 增大反应体积以稀释可能的抑制剂; 延长反应时间; 消化基因组DNA时,加入终浓度1-2.5m mol/L多聚阳离子亚精胺可改善酶切效果,其作用是结合带负电荷的污染物; 纯化DNA。,酶切反应的终止,加入终农度为12.5m mol/L的EDTA以鳌合镁离子而终止酶的反应; 多数酶在65C 10分钟可被不可逆灭活,少数65C不失活的酶在75 C 15分钟也能失活; 若酶对热具完全抗性,可通过酚抽提乙醇沉淀来纯化。,酶切产物的纯化(pUC19),加入ddH2O 155 l (扩大体积),加入200l氯仿/异戊醇(24:1),颠倒混匀后12000rpm离心10 min; 吸出上清,加1/10
16、体积3M NaAc和两倍体积乙醇,-20放置15分钟以上; 12000 rpm 4冷冻离心15分钟; 倒去上清,用500 l 75乙醇浸洗沉淀; 12000 rpm 4冷冻离心5分钟; 吹干后 DNA溶于10 l ddH2O。,氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用,它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏,操作时需戴手套、安全镜并在通风橱中进行。 苯酚是强腐蚀剂,能引起严重烧伤;操作时应戴手套、安全镜、穿防护服,并在通风橱中进行。,注意,当一个体系中有多种DNA分子,而我们只需要其中的某种DNA时或者反应体系中含有目的DNA以外的其它分子如各种工具酶、dNTPs、引物及矿物油等时,可以利用凝胶电泳分离各种DNA,然后挖胶回收目的DNA 带。 回收方法主要有: 1.低熔点琼脂糖 2.透析带电洗脱