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1、分子生物学常用技术,PCR产物,A-T克隆,测序,重组表达载体,重 组 蛋 白,制备抗体,转 染 细 胞,(1)PCR (2)核酸的纯化：凝胶回收Kit (3)连接反应：16过夜/22 2h (4)CaCl2法制备感受态细胞：Kit (5)宿主菌的转化及蓝白筛选 (6)挑克隆：2ml 含抗生素的LB (7)提质粒：Kit (8)重组质粒的鉴定：双酶切反应、菌落PCR (9)测序：生物技术服务公司 (10)菌种保存: 2030%甘油-LB，-20/-70 ,步骤：,(11)外源基因在哺乳动物细胞中的表达：质粒转染、电转染 (12)目的基因表达的鉴定：RT-PCR、Northern Blot、 原
2、位杂交、Southern Blot (13)目的蛋白表达的检测： 原核表达：SDS-PAGE (重组蛋白诱导表达的诱导剂浓度、 诱导时间和温度、重组蛋白表达的形式)、WB 真核表达：Western Blot、ELISA、免疫组化,(14)重组蛋白的纯化：亲和层析，His-tag/GST-tag (15)制备抗体：多抗和单抗 (16)基因功能检测：提高/降低表达水平 细胞周期检测：流式细胞仪 细胞增殖检测：MTT 细胞凋亡检测: 流式细胞仪、TUNEL、DNA Ladder 抑瘤活性检测：体外、体内 对血管化的影响 。 (17)作用机制,实验 XXX 设备：加样器 耗材 试剂和配制方法：详细 步
3、骤：详细,1. 核酸的分离纯化和鉴定: 基因组DNA、总RNA、质粒 2. 基因的克隆与鉴定方法 3. 外源基因转移技术和表达体系 4. 检测方法：电泳技术：agarose、SDS-PAGE 分子杂交: SB、NB、WB、基因芯片技术 DNA序列测定 生物信息学分析技术 5. 基因功能研究的方法 6. 组学研究技术：基因组学、蛋白质组学,内容,核酸的基本组成,Albrecht Kossel,1910年诺贝尔生理或医学奖,揭示核酸的化学成分,“其对蛋白质，包括核物质的研究工作为我们了解细胞化学作出了贡献”,Lord (Alexander R.) Todd,核苷酸的基本结构,1957年诺贝尔化学奖
4、,“核苷和核苷辅酶”,1962年诺贝尔生理或医学奖,“发现核酸的分子结构及其对于生命物质信息传递的重要意义”,DNA分子的二级结构,数量庞大 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 3，5-磷酸二酯键(共价键) 直线形多聚体 方向: 5-3 ，5 CAG 3,特点,DNA半保留复制,变性与复性,变性：指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链， 不涉及共价键断裂，不引起分子量降低。,一、核酸的分离、纯化和鉴定 基因组DNA的分离、纯化： PCR、Southern- blot、构建基因组文库 实验材料：哺乳动物组织(50100mg) 哺乳动物细胞(5x105107) 六孔板/T25,实
5、验步骤：RT 匀浆：TE pH8.0 组织( 液氮冻存、研磨) 消化：EDTA 、SDS、蛋白酶K、RNase、37/55 抽提：酚、氯仿、异戊醇 沉淀：异丙醇 / NaAc + 无水乙醇 洗涤：75乙醇 干燥：风干 溶解：TE / H2O,注意事项： (1) 试剂：pH值准确 (2) 蛋白酶K：20mg/ml， 分装，-20，避免反复冻融 (3) 抽提：完全，不要触及蛋白层 (4) 干燥：避免过分 (5) 操作：小心，机械剪切作用，80100kb,2. 总RNA的分离纯化: 略,3. 质粒：细菌等微生物细胞染色体以外，能独立进行 复制和遗传，赋予宿主细胞一定生物学性状 的共价闭环双链DNA分
6、子。,合格质粒的组成要素,复制起始位点：原核1个，真核多个 抗性基因 多克隆位点 启动子 增强子 终止信号 加polyA信号,第二步：筛选标记：如抗性，决定使用什么筛选标记： （1）Ampr ：水解-内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr ：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor：氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物）失活。 （5）hygr： 使潮霉素失活。,如何阅读质粒？,第一步：质粒类型：Ori位置，原核/真核/穿梭质粒；,第三步：多克隆位点，内切酶位点,第四步：外源基因插入片段大小，10kb， 大选大小找小,第五
7、步：表达系统元件：启动子 - 核糖体结合位点 - 克隆位点 - 转录终止信号。 克隆载体/表达载体,碱裂解法,Omega：Plasmid Mini KitI D6943-01 ？,4、核酸纯度的鉴定,OD260和OD280应大于0.05,OD260：DNA, RNA; OD280：蛋白质,浓度：1OD260：50g/ml 双链 DNA 40g/ml 单链 DNA，总RNA 35g/ml 单链RNA 20g/ml 单链寡核苷酸,纯度: OD260 / OD280 ：蛋白质污染程度，DNA 1.8，RNA 1.72.1 OD260 / OD230 ：碳水化合物污染程度，2.0,二、基因的克隆与鉴定
8、方法,基因的化学合成 目的基因的克隆策略 (1) 根据已知碱基或氨基酸序列克隆基因 (2) 根据表型变异克隆基因 (3) 基于图谱的基因克隆方法 3. 文库的构建与目的基因的克隆 4. PCR反应与目的基因的克隆 5. 目的基因克隆的鉴别与分析,基因的化学合成 前提条件：已知基因的核苷酸序列或蛋白质的氨基酸序列 适用：分子量较小、价值极高的目的基因 历史：1979年， Khorana等首次合成E coli酪氨酸tRNA基因 方法：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法 方式：固相合成法和自动合成法,2. 目的基因的克隆策略,(1)根据已知碱基或氨基酸序列克隆基因 a.一个基因的序列已知：PCR技
9、术，目的DNA片段,b.一个基因的一段碱基序列已知： 反向PCR/RACE，cDNA全长； 探针：筛选cDNA文库，cDNA全长,c.一个或多个物种的某种基因序列已知：同源性比较， 保守序列，探针/引物，文库筛选/PCR，从新物种中 分离功能相似的基因,d.已知蛋白质的氨基酸序列：密码子的兼并性，可能的 核苷酸序列，探针，筛选基因组/cDNA文库，基因序列,(2)根据表型变异克隆基因：未知序列基因的克隆,转座子示踪技术：又称转座子标签法，酵母和植物,a.提总RNA: 具有对比意义的两组，注意痕量DNA的污染 b.反转录：得到细胞内所有基因的cDNA库 下游引物：12组，T12MN(M:A、C、
10、G; N:A、C、G、T) c.PCR扩增：32P，35S 上游引物：2426组，10mer 下游引物：同反转录 共计288312种PCR反应,mRNA 差异显示： DD-PCR，1992，只能分离与某种 处理或特征有关的基因,步骤：,d.电泳：测序胶或非变性聚丙烯酰胺凝胶，放射自显影 e.克隆：PCR差异带的回收、扩增和克隆 f.Northern blotting鉴定：排除假阳性 g. 序列分析：Blast，递交新序列 h.全长基因： RACE或筛选cDNA文库 i.基因功能研究：生物信息学,扩增条件： 前14个循环采用不严格扩增条件(降低退火温度， 增加引物与Mg2+浓度)，促使引物与模板
11、的错配； 后续PCR循环则采用严格的扩增条件。,基因片段的开放读框 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html,氨基酸序列的功能结构域分析 http:/www.smart.embl-heidelberg.de http:/www.ebi.ac.uk/interproscan/ipsearch.html,注意： a.与常规PCR不同，该方法可以保持样品中不同模板的相对比例; b.由于某一刺激因素常常影响数十、甚至数百基因的表达变化，但并不是每个基因的表达变化在此过程都起着重要的作用; c. 电泳显示的单一扩增带并不表明它只含有单一的基因。,优点：操作简单、
12、敏感、快速、重复性好、要求的起始RNA量 少、可同时检测某因素作用下表达升高与降低的基因。 缺点：大规模地筛选，假阳性率高，得到的多为短片段， 且都靠近3端,发展：EDD、ODD、GDD、LDD、FDD(增强、有序、基因组、长程、荧光),消减杂交：又称扣除杂交，克隆差异表达的基因,(3)基于图谱的基因克隆方法：依赖于遗传图谱和物理图谱， 可以用来分离与已知分子标记紧密连锁的基因。,方法：染色体跳查：速度快，200kb片段 染色体步查：40kb片段,举例：囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)-囊性纤维化(常隐) 亨廷顿病基因(HD)-亨廷顿病(常显) 肌营养不良基因(MD)-肌营养不良症(X隐
13、),3. 文库的构建与目的基因的克隆,分类：按组成基因文库的重组DNA片段的供体来源分为两类 cDNA文库：重组DNA片段来源于细胞表达出的mRNA， 用于某类特定细胞中基因组的表达状态以及 表达基因的功能鉴定的研究。 基因组文库：重组片段供体是某种特定生物个体的基因组DNA， 主要用于基因组物理图谱构建、基因组序列分析、 基因在染色体上的定位、基因组中基因的结构和 组织形式分析等方面的研究。,基因文库：指采用体外克隆技术得到的一个重组DNA分子群体。,(1)cDNA文库,步骤：cDNA合成，连接到质粒/噬菌体载体上， 转化或感染大肠杆菌，产生cDNA文库。,cDNA = copy DNA,c
14、DNA文库的筛选：,(2)基因组文库,概念：是由大量独立克隆形成的群体，指能够代表某种 有机体整个基因组的一套克隆。,步骤：DNA样品的制备用限制性内切酶酶切基因组DNA 电泳分离回收约20kb的大片段与限制性内切酶处理 的载体连接在体外包装成噬菌体颗粒，侵染大肠杆 菌文库的扩增,4. PCR反应与目的基因的克隆,发展历史 基本原理 反应体系 常见类型 建立PCR实验室,Kary B. Mullis,Michael Smith,PCR和定点突变突变,1993年诺贝尔化学奖,“发明了聚合酶链反应(PCR)的方法”,“开创了基于寡聚核苷酸的定点突变 方法及其在蛋白质研究中的发展”,(1)PCR发展
15、史,1. 1983年春，Mullis提出PCR的概念； 2. 1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做第一个PCR实验，只一个循环； 3. 1983年12月，同位素标记的10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断； 4. 1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒； 5. 1985年10月25日申请PCR专利，1987年7月28日批准(专利号 4,683,202），这次Mullis是第一发明人。 6. 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界开始学习PCR方法； 7
16、. 1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，这是1985年春天Mullis建议做的； 8. 1988年，第一台PCR仪问世； 9. 1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元代价从Cetus公司获得全权开发权。 10.1993年，Mullis获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。,PCR仪的变迁,1. 三个水浴锅， 用手移动（Mullis等人当时用的） 2. 电加热块 自来水冷却 （PE，1988） 3. 电加热块 内置循环液冷却（PE，1989） 4. 三个加热块 机械手（Stratagene，1994） 5. 半导体制冷和加热（MJ, PE, BioMetra, Eppendrof） 6. 温度梯度, 荧光检测 (如 Roche的Lightcycler) 7. 风加热 8. Lab-on-chip式的PC
